从转染的 Naegleria gruberi 滋养体中分离含染色体的封闭环状核糖体 DNA （rDNA） 元素 （CERE） 和 PCR 分析

首先，将 200 微升 100 毫摩尔氯化钠添加到含有转染的 Naegleria gruberi 滋养体的试管中。将试管在 600 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于 100 μL 100 毫摩尔 EDTA 中。

将试管置于 98 摄氏度的加热块中 15 分钟以裂解细胞。将试管在 4 °C 下以最高速度离心 10 分钟，以沉淀碎片。将上清液转移到新试管中。

接下来，向上清液中加入 0.5 体积的乙酸铵、3 体积的无水乙醇和 1 微升糖原。将试管倒置数次以混合，然后在零下 80 摄氏度下孵育 30 分钟或过夜。孵育后，将试管在室温下以 16， 000G 离心 10 分钟。

在不干扰沉淀的情况下去除上清液，并在离心前加入 200 微升 70% 乙醇进行洗涤。将干燥的沉淀重悬于无菌去离子水中，以达到每微升 10， 000 个滋养体的滋养体密度。使用转染 DNA 的特异性引物进行 PCR 并检测转化的滋养体后，向 CERE 样品中加入 2 μL 6X 上样染料。

然后，将染色的样品加载到 0.8% 琼脂糖凝胶上。对凝胶进行电荧光 1.5 至 2 小时后，将其放入用 100 毫升去离子水稀释的 DNA 染料中孵育。将染色的凝胶转移到去离子水中 20 分钟以使其脱色。

在紫外光系统上观察凝胶以记录结果。PCR 分析显示，通过至少 7 次传代，在转染滋养体中检测到 pGRUB。pGEM 在第一次传代后丢失，表明空质粒没有被变形虫保留。