Questi studi sono stati parzialmente finanziati da una sovvenzione del George F. Haddix Fund della Creighton University (KMD). La Figura 1 viene generata in biorender.com e la Figura 3 viene generata in benchling.com.

I dettagli delle specie, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. La sequenza del costrutto pGRUB di 17.004 coppie di basi è fornita nel File supplementare 1.
1. Allevamento di trofozoiti
<ol><li>Scongelare i trofozoiti di N. gruberi congelati a 37 °C per 3 min.</li>
	<li>Inoculare i trofozoiti in fiasche T25 in peptone/estratto di lievito/acido nucleico/acido folico/emina modificati con il 10% di siero fetale di vitello (PYNFH) più il 2% di tampone (fosfato disodico, fosfato monobasico di potassio).</li>
	<li>Coltivare i trofozoiti a 25 °C fino a ~80% confluenti, dove mostrano una morfologia ameboide (Figura 2A). NOTA: Quando si fa inizialmente rivivere una coltura di trofozoiti dal loro stato congelato, possono essere necessari fino a 5-7 giorni prima che un T25 diventi confluente. Decantare il supporto ogni 3-4 giorni e sostituirlo con un supporto nuovo.</li>
	<li>Posizionare i palloni confluenti sul ghiaccio per 5-10 minuti per rilasciare i trofozoiti aderiti dalla plastica. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere le cellule aderenti rimanenti. I trofozoiti hanno ora una morfologia "arrotondata" (Figura 2B).</li>
	<li>Suddividere le colture da 1:2 a 1:4 in nuovi flaconi per colture tissutali.</li>
	<li>Rimuovere il PYNFH e sostituirlo con mezzi di incistamento sterili (120 mM di cloruro di sodio, 0,03 mM di cloruro di magnesio, 1 mM di fosfato disodico, 1 mM di fosfato monobasico di potassio, 0,03 mM di cloruro di calcio, 0,02 mM di cloruro di ferro, pH 6,8)22 per incistare il N. gruberi. NOTA: La maggior parte dei trofozoiti diventa incistata entro 72 ore (Figura 2C). L'escussione deve essere completata entro 72 ore.</li>
	<li>Rimuovere le cisti dai palloni, centrifugare a 600 x g per 10 minuti a 20 °C e risospendere le cisti in terreno PYNFH con il 10% di siero fetale di vitello per asportare le cellule. Incubare a 25 °C per 24 ore fino a quando i trofozoiti iniziano a emergere.</li>
</ol>2. Trasfezione dei trofozoiti
<ol><li>Preparare i trofozoiti in una piastra di coltura tissutale a fondo piatto a 6 pozzetti (1 mL di 1 x 106 trofozoiti/mL) e coltivare a 25 °C.</li>
	<li>Trasfettare le cellule quando raggiungono il 70%-80% di confluenza (~10,4 x 104 cellule/cm2 in cluster a 6 pozzetti). Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la miscela di reagenti plasmidico-trasfezione come segue: 75 ng di DNA plasmidico e 0,225 μL di reagente di trasfezione in 200 μL di terreno PYNFH senza FBS. Preparare una miscela di reagenti plasmide-trasfezione sufficiente per eseguire la trasfezione in duplicato. NOTA: In questo studio è stato utilizzato un plasmide batterico contenente un clone completo di N. gruberi CERE (pGRUB). Il plasmide vuoto (pGEM) è stato utilizzato come controllo negativo (Figura 3).</li>
	<li>Incubare la miscela di reagenti plasmidi-trasfezione a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere ~800 μL di terreno dai monostrati di trofozoite appena prima della trasfezione.</li>
	<li>Mettere la miscela di reagenti plasmidi-trasfezione sui trofozoiti.</li>
	<li>Agitare delicatamente la lastra ogni 15 minuti per evitare che il supporto si aggreghi ai bordi della lastra.</li>
	<li>Lavare i monostrati una volta con 2 mL di terreno di crescita dopo 1 ora di incubazione a 25 °C.</li>
	<li>Trattare i monostrati con 10 U DNasi in 1 mL di tampone DNasi 10x per 15 minuti a 37 °C per rimuovere il DNA plasmidico residuo, lavare una volta con terreno di crescita, aggiungere 2 mL di terreno fresco e posizionare a 25°C. Incubare la piastra per 24-36 ore.</li>
	<li>Mettere la piastra sul ghiaccio per 10 minuti per rilasciare le cellule.</li>
	<li>Dividi un pozzo (1:2) in due nuovi pozzi.</li>
	<li>Raccogli i trofozoiti dai pozzi rimanenti per scopi sperimentali. NOTA: tutte le impostazioni cultura vengono eseguite in duplicato. Per ogni condizione, 1 pozzetto viene utilizzato per il passaggio e 1 viene utilizzato per l'isolamento CERE.</li>
</ol>3. Isolamento di CERE da Naegleria
<ol><li>Calcolare il numero di trofozoiti in ciascun pozzetto utilizzato per l'isolamento CERE mediante colorazione di esclusione con blu di tripano e un emocitometro23.</li>
	<li>Mettere i trofozoiti in una provetta da 2,0 mL.</li>
	<li>Lavare i trofozoiti una volta ogni 100 mM di cloruro di sodio (pH 7,5) mediante centrifugazione (600 x g, 10 min, 4 °C). NOTA: Il cloruro di sodio impedisce ai trofozoiti di aderire ai lati del tubo.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di EDTA 100 mM (pH 7,5).</li>
	<li>Mettere la provetta in un blocco termico per 15 minuti a 98 °C per lisare le cellule e inattivare gli enzimi nei trofozoiti. NOTA: Questo passaggio inattiva le DNasi, che sono abbondanti nei trofozoiti di Naegleria . Le DNasi possono interferire con la capacità di rilevare il CERE nativo e il clone molecolare nella fase 4. La resa del DNA diminuisce quando vengono utilizzate oltre ~3 x 106 celle nel passaggio 3.4.</li>
	<li>Centrifugare le provette alla massima velocità (16.000 x g) a 4 °C per 10 minuti per pellettare i detriti.</li>
	<li>Trasferire i surnatanti in una nuova provetta.</li>
	<li>L'etanolo precipita i surnatanti con 0,5 volumi di acetato di ammonio 7,5 M (pH 7,5), 3 volumi di etanolo assoluto e 1 μL di glicogeno 10 mg/mL come vettore.</li>
	<li>Capovolgere la provetta più volte e posizionarla a -80 °C per almeno 1 ora o durante la notte.</li>
	<li>Riscaldare i campioni a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 10 minuti a 16.000 x g.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con etanolo al 70% mediante centrifugazione per 5 minuti a 16.000 x g (a temperatura ambiente).</li>
	<li>Rimuovere l'etanolo e asciugare il pellet all'aria per 5 minuti.</li>
	<li>Risospendere il pellet essiccato in acqua deionizzata sterile (DI). Normalizzare il volume a 10.000 trofozoiti per μL.</li>
	<li>Conservare a -80 °C fino all'uso in PCR.</li>
</ol>4. Rilevamento PCR di trofozoiti trasformati
<ol><li>Utilizzare 20.000 cellule equivalenti di DNA, primer da 600 nM (Tabella 1) e Taq polimerasi ed eseguire la PCR24. NOTA: I primer che distinguono tra CERE nativo e CERE clonato sono elencati nella Tabella 1, così come le condizioni di PCR. La Figura 3 mostra la posizione degli inneschi sui costrutti. La PCR richiederà un'ottimizzazione a seconda dei primer utilizzati e della specifica miscela PCR utilizzata.</li>
	<li>Microonde 0,8% di agarosio in 1x Tris base, acido acetico e tampone EDTA (TAE) fino a quando l'agarosio non si è sciolto.</li>
	<li>Raffreddare l'agarosio a ~50 °C a temperatura ambiente.</li>
	<li>Versare la soluzione in una vaschetta di colata di gel contenente un pettine per formare dei pozzetti.</li>
	<li>Lascia riposare il gel a temperatura ambiente fino a quando non si sarà solidificato.</li>
	<li>Posizionare il gel nell'apparecchio per elettroforesi.</li>
	<li>Decantare 1x TAE nella camera di elettroforesi fino a coprire il gel.</li>
	<li>Rimuovere il pettine.</li>
	<li>Aggiungere 6 coloranti di caricamento (0,25% blu di bromfenolo, 0,25% xilene cianolo, 30% glicerolo) ai campioni e caricare il gel. Utilizzare una scala del DNA per determinare le dimensioni del prodotto PCR.</li>
	<li>Collegare l'elettrodo, accendere l'alimentatore e far funzionare il gel a 80 V per ~1,5-2 ore.</li>
	<li>Spegnere l'alimentazione e rimuovere il gel.</li>
	<li>Colorare il gel con colorante DNA (ad es. 10 μL di 10 mg/mL di bromuro di etidio) in 100 mL di acqua deionizzata per 10 minuti.</li>
	<li>Lasciare il gel per 20 minuti in acqua deionizzata.</li>
	<li>Visualizza il gel su un sistema a luce ultravioletta (UV) e documenta i risultati.</li>
</ol>

Utilizzo di un vettore basato su CERE per la trasfezione dei trofozoiti di Naegleria gruberi

<ol>
	<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+we+know+by+now+about+the+genus+Naegleria.">What do we know by now about the genus Naegleria.</a> Exp Parasitol. 145, S2-S9 (2014).</li><li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+research+on+the+Amoeboflagellate+genus+Naegleria.">A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria.</a> Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).</li><li>Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+in+Naegleria+gruberi.">Cell differentiation in Naegleria gruberi.</a> Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).</li><li>Grace, E., Asbill, S., Virga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naegleria+fowleri:+Pathogenesis,+diagnosis,+and+treatment+options.">Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options.</a> AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).</li><li>Moseman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Battling+brain-eating+amoeba:+enigmas+surrounding+immunity+to+Naegleria+fowleri.">Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri.</a> PLOS Pathog. 16 (4), e1008406 (2020).</li><li>Marciano-Cabral, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Naegleria+spp.">Biology of Naegleria spp.</a> Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).</li><li>Pi&#241;ero, J. E., Oma&#241;a-Molina, M., Ch&#225;vez-Mungu&#237;a, B., Lorenzo-Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naegleria+fowleri.">Naegleria fowleri.</a> Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).</li><li>Zysset-Burri, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+pathogenicity+factors+of+the+free-living+amoeba+Naegleria+fowleri.">Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri.</a> BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).</li><li>Liechti, N., Sch&#252;rch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+Naegleria+lovaniensis,+the+basis+for+a+comparative+approach+to+unravel+pathogenicity+factors+of+the+human+pathogenic+amoeba+N.+fowleri.">The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri.</a> BMC Genom. 19, 654-665 (2018).</li><li>Liechti, N., Sch&#252;rch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+sequencing+improves+the+draft+genome+of+the+human+pathogenic+amoeba+Naegleria+fowleri.">Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri.</a> Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).</li><li>Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Naegleria+genome:+A+free-living+microbial+eukaryote+lends+unique+insights+into+core+eukaryotic+cell+biology.">The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology.</a> Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).</li><li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+genes+of+Naegleria+gruberi+are+carried+exclusively+on+a+14-kilobase-pair+plasmid.">rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid.</a> Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).</li><li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+ribosomal+RNA+genes+are+a+general+feature+of+schizopyrenid+amoebae.">Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae.</a> J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).</li><li>Dao, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identify+origin+of+replication+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+two-step+feature+selection+technique.">Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique.</a> Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).</li><li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+gruberi+strain+EGB+ribosomal+DNA.">Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA.</a> Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).</li><li>Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Naegleria+fowleri+(strain+LEE)+closed+circular+extrachromosomal+ribosomal+DNA+element.">Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element.</a> Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055 (2020).</li><li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extrachromosomal+elements+of+the+Naegleria+amoebae:+How+little+we+know.">The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know.</a> Plasmid. 115, 102567 (2021).</li><li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+(CERE)+of+Naegleria+australiensis+De+Jonckheere+(strain+PP+397).">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397).</a> Microbiol Resource Announce. 12, e0032123 (2023).</li><li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+jadini+Willaert+and+Ray+(Strain+ITMAP400).">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400).</a> Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123 (2023).</li><li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+(CERE)+of+Naegleria+pringsheimi+De+Jonckheere+(strain+Singh).">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh).</a> Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).</li><li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+single+origin+of+replication+in+the+Naegleria+gruberi+extrachromosomal+DNA+element.">Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element.</a> Protist. 170, 141-152 (2019).</li><li>Sohn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+liquid+media+for+encystation+of+pathogenic+free-living+amoebae.">Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae.</a> Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Jeong, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+nfa1+gene+cloned+from+pathogenic+Naegleria+fowleri+in+non-pathogenic+N.+gruberi+enhances+cytotoxicity+against+CHO+target+cells+in+vitro.">Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro.</a> Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).</li><li>Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+evolutionary+divergence+in+the+genus+Naegleria+by+analysis+of+ribosomal+DNA+plasmid+restriction+patterns.">Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns.</a> Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).</li><li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variation+in+the+ribosomal+internal+transcribed+spacers,+including+the+5.8S+rDNA,+of+Naegleria+spp.">Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp.</a> Protist. 149 (3), 221-228 (1998).</li><li>Rawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+prediction+of+G4+DNA+as+regulatory+motifs:+Role+in+Escherichia+coli+global+regulation.">Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation.</a> Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).</li><li>Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuadBase:+Genome-wide+database+of+G4+DNA+-+occurrence+and+conservation+in+human,+chimpanzee,+mouse+and+rat+promoters+and+146+microbes.">QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes.</a> Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).</li></ol>

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse finanziari.

Il protocollo qui delineato è molto semplice, anche se ogni costrutto richiederà probabilmente un certo grado di ottimizzazione, in particolare del rapporto reagente DNA-trasfezione, a seconda della natura del costrutto e della specie di Naegleria utilizzata. Abbiamo testato solo un reagente di trasfezione disponibile in commercio utilizzando questo protocollo, ma è probabile che molti altri possano essere efficaci. Dato che viene utilizzato un clone a lunghezza intera del CERE, contenente un'origine funziona...

Il genere Naegleria contiene oltre 45 specie, anche se è improbabile che tutti i membri della specie siano stati identificati1. La Naegleria può esistere in diverse forme: come trofozoiti (amebe), come flagellati o, quando le risorse sono fortemente limitate, come cisti 1,2,3,4. Il genere Naegleria è noto per la sua specie particolarmente pericolosa, Naegleria fowleri, nota come "l'ameba mangia-cervello" (recensita in 1,2,3,4,5,6,7), che è la causa della meningoencefalite amebica primaria quasi universalmente fatale.
Naegleria codifica il loro rDNA sul CERE situato nel nucleolo. Il sequenziamento completo dei genomi di tre specie di Naegleria conferma l'assenza di rDNA nel genoma nucleare 8,9,10,11. Sulla base delle limitate sequenze CERE a lunghezza intera, il CERE varia da circa 10 kbp a 18 kbp di lunghezza. I CERE di ogni specie di Naegleria portano un singolo cistrone di rDNA (contenente il DNA ribosomiale 5,8, 18 e 28S) su ciascuno dei circa 4.000 CERE per cellula 12,13,14. Oltre all'rDNA, ogni CERE ha una grande sequenza non di rDNA (NRS). Le dimensioni del CERE variano da specie a specie; le differenze sono dovute principalmente alla lunghezza variabile dell'NRS, poiché le sequenze di rDNA sono altamente conservate in tutto il genere 1,15,16,17,18,19,20. La mappatura di una singola origine della replicazione del DNA all'interno di N. gruberi CERE NRS21 fornisce un forte supporto all'ipotesi che Naegleria CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare.
N. gruberi è un'ameba non patogena spesso utilizzata per studiare la biologia della Naegleria . Abbiamo sviluppato una metodologia per trasformare i trofozoiti di N. gruberi con un clone di CERE della stessa specie per testare l'ipotesi che le amebe Naegleria tollerino e replichino indipendentemente il CERE all'interno dei trofozoiti. Ciò è stato ottenuto trasformando N. gruberi con un clone completo di N. gruberi CERE in trofozoiti e seguendo i destini del clone CERE donatore mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). Una panoramica generale del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dati qui presentati dimostrano che il clone donatore può essere rilevato attraverso almeno sette passaggi in coltura tissutale, nonché essere mantenuto attraverso incistamento ed escissione. Questi studi costituiscono la base per analizzare il modo in cui CERE si replica, nonché per esplorare il suo uso come vettore per trasfettare Naegleria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-3102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A-7330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks, T-75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plate, 6-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D-4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electropheresis Gel Apparatus</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>80-6052-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes, 2 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E-8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7876-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UN2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Block</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88871001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>372870-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magneisum Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MySpin 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N. gruberi</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleic Acid</td>
			<td>Chem Impex Int&#8217;l</td>
			<td>#01625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MCB Reagents</td>
			<td>SX0420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaFect Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Scale</td>
			<td>Denver Instruments</td>
			<td>APX-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection of a molecular clone of naegleria gruberi rdna into n. gruberi trophozoites

Tutti i geni ribosomiali dei trofozoiti di Naegleria sono mantenuti in un elemento circolare chiuso contenente DNA ribosomiale extracromosomico (rDNA) (CERE). Mentre si sa poco sul CERE, un'analisi completa della sequenza del genoma di tre specie di Naegleria dimostra chiaramente che non ci sono cistrroni di rDNA nel genoma nucleare. Inoltre, una singola origine di replicazione del DNA è stata mappata nel CERE di N. gruberi , supportando l'ipotesi che il CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare. Questa caratteristica del CERE suggerisce che potrebbe essere possibile utilizzare il CERE ingegnerizzato per introdurre proteine estranee nei trofozoiti di Naegleria . Come primo passo nell'esplorazione dell'uso di un CERE come vettore in Naegleria, abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare N. gruberi con un clone molecolare di N. gruberi CERE clonato in pGEM7zf+ (pGRUB). Dopo la trasfezione, pGRUB è stato prontamente rilevato nei trofozoiti di N. gruberi per almeno sette passaggi, nonché attraverso incistamento ed escissione. Come controllo, i trofozoiti sono stati trasfettati con il vettore backbone, pGEM7zf+, senza le sequenze di N. gruberi (pGEM). Il pGEM non è stato rilevato dopo il primo passaggio successivo alla trasfezione in N. gruberi, indicando la sua incapacità di replicarsi in un organismo eucariotico. Questi studi descrivono un protocollo di trasfezione per i trofozoiti di Naegleria e dimostrano che la sequenza plasmidica batterica in pGRUB non inibisce la trasfezione e la replicazione del clone CERE trasfettato. Inoltre, questo protocollo di trasfezione sarà fondamentale per comprendere la sequenza minima del CERE che guida la sua replicazione nei trofozoiti, nonché per identificare le regioni regolatorie nella sequenza non ribosomiale (NRS).

The Naegleria genus contains over 45 species, although it is unlikely that all members of the species have been identified1. Naegleria can exist in different forms: as trophozoites (amoebae), as flagellates, or, when resources are severely limited, as cysts1,2,3,4. The Naegleria genus is recognized for its one particularly dangerous species, Naegleria fowleri, known as &#39;the brain-eating amoeba&#39; (reviewed in1,2,3,4,5,6,7), which is the cause of the almost universally fatal primary amoebic meningoencephalitis.
Naegleria encode their rDNA on the CERE located in the nucleolus. Complete sequencing of three Naegleria species&#39; genomes confirms the absence of rDNA in the nuclear genome8,9,10,11. Based on the limited full-length CERE sequences, the CERE ranges from approximately 10 kbp to 18 kbp in length. CERE of each species of Naegleria carry a single rDNA cistron (containing the 5.8, 18, and 28S ribosomal DNA) on each of approximately 4,000 CERE per cell12,13,14. Other than rDNA, each CERE has a large non-rDNA sequence (NRS). CERE sizes vary between species; the differences are mainly due to the varying length of the NRS, as the rDNA sequences are highly conserved across the genus1,15,16,17,18,19,20. The mapping of a single origin of DNA replication within the N. gruberi CERE NRS21 provides strong support for the hypothesis that Naegleria CERE replicates independently of the nuclear genome.
N. gruberi is a non-pathogenic amoeba often used to study Naegleria biology. We developed a methodology for transforming N. gruberi trophozoites with a CERE clone from the same species to test the hypothesis that Naegleria amoebae tolerate and independently replicate CERE within the trophozoites. This was accomplished by transforming N. gruberi with a full-length clone of N. gruberi CERE into trophozoites and following the fates of the donor CERE clone by polymerase chain reaction (PCR). A general overview of the protocol is outlined in Figure 1. The data presented herein demonstrate that the donor clone can be detected through at least seven passages in tissue culture, as well as be maintained through encystment and excystment. These studies form the basis for a means to dissect how CERE replicates, as well as explore its use as a vector to transfect Naegleria.

Autore in primo piano: Comprensione della propagazione dell'elemento contenente rDNA extracromosomico circolare chiuso (CERE) in Naegleria gruberi

Trasfezione di un clone molecolare di rDNA di Naegleria gruberi in trofozoiti di N. gruberi

La PCR dei trofozoiti che sono stati trasfettati con pGRUB dimostra che il CERE trasfettato viene rilevato attraverso almeno sette passaggi dei trofozoiti, nonché incistamento ed escisto (Figura 4). I primer utilizzati nella PCR ricottura sia al vettore pGEM che alla sequenza CERE, garantendo così che la PCR non rilevi il CERE nativo. La PCR dopo la trasfezione di pGEM in trofozoiti ha indicato che pGEM era negativo (Figura 4), indicando che il plasmide vuoto ...

Questo protocollo descrive una metodologia per trasfettare i trofozoiti di Naegleria gruberi con un costrutto che viene mantenuto per tutta la durata del passaggio dei trofozoiti in vitro, nonché attraverso l'incistamento e l'escissione.

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

transfection-molecular-clone-naegleria-gruberi-rdna-into-n-gruberi

Research

JoVE Journal

Biology

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

358 Views.  Creighton University School of Medicine. La nostra ricerca rappresenta il primo passo per capire quale sequenza è contenuta nel DNA ribosomiale extracromosomico circolare chiuso, o CERE, che è fondamentale per consentire la replicazione del CERE. Oltre a comprendere il meccanismo di replicazione del DNA del CERE. Questo protocollo affronta le lacune nella comprensione di come il CERE propaga una naegleria gruberi e quali componenti del CERE sono necessari per una propagazione efficace.Il no...

Video: Autore in primo piano: Comprensione della propagazione dell'elemento contenente rDNA extracromosomico circolare chiuso (CERE) in Naegleria gruberi

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While little is known about the CERE, a complete genome sequence analysis of three Naegleria species clearly demonstrates that there are no rDNA cistrons in the nuclear genome. Furthermore, a single DNA origin of replication has been mapped in the N. gruberi CERE, supporting the hypothesis that CERE replicates independently of the nuclear genome. This CERE characteristic suggests that it may be possible to use engineered CERE to introduce foreign proteins into Naegleria trophozoites. As the first step in exploring the use of a CERE as a vector in Naegleria, we developed a protocol to transfect N. gruberi with a molecular clone of the N. gruberi CERE cloned into pGEM7zf+ (pGRUB). Following transfection, pGRUB was readily detected in N. gruberi trophozoites for at least seven passages, as well as through encystment and excystment. As a control, trophozoites were transfected with the backbone vector, pGEM7zf+, without the N. gruberi sequences (pGEM). pGEM was not detected after the first passage following transfection into N. gruberi, indicating its inability to replicate in a eukaryotic organism. These studies describe a transfection protocol for Naegleria trophozoites and demonstrate that the bacterial plasmid sequence in pGRUB does not inhibit successful transfection and replication of the transfected CERE clone. Furthermore, this transfection protocol will be critical in understanding the minimal sequence of the CERE that drives its replication in trophozoites, as well as identifying regulatory regions in the non-ribosomal sequence (NRS).

This protocol describes a methodology to transfect Naegleria gruberi trophozoites with a construct that is maintained throughout passaging trophozoites in vitro, as well as through encystment and excystment.

Ricerca

Biologia

Culture and Transfection of Naegleria gruberi Trophozoites for Molecular Studies

Coltura e Trasfezione di Trofozoiti di Naegleria gruberi per studi molecolari

Closed Circular Extrachromosomal Ribosomal DNA (rDNA) Containing Element (CERE) Isolation from Transfected Naegleria Gruberi Trophozoites and PCR Analysis

Isolamento circolare chiuso di DNA ribosomiale ribosomiale (rDNA) contenente elementi (CERE) da trofozoiti di Naegleria Gruberi trasfettati e analisi PCR