首先，将新鲜制备的扩增培养基、过滤灭菌的蛋白酶和抗生素溶液以及灭菌的手术器械放在生物安全柜的工作平台上。将大鼠尾胶原添加到 100 毫米培养皿和 24 毫米反式孔中。将培养皿在紫外线下打开过夜以进行消毒。
将安乐死的小鼠浸入 75% 乙醇中进行灭菌。不要浸入鼻子和嘴巴。使用手术剪刀和镊子，从小鼠的下颌到腹腔切割并打开表皮。
使用另一组手术剪刀和镊子，撕开两侧的甲状腺，去除气管、周围肌肉组织和食道之间的连接。接下来，小心切开胸部，并使用镊子深入胸腔。取出整个肺，找到气管的末端。
从甲状软骨到气管支气管支气管分支切出气管，并将其放入含有四种抗生素的预冷膨胀培养基中。在将管子放在冰上之前，摇晃管子以尽可能多地冲洗掉气管表面的血液。现在将气管转移到含有四种抗生素的预冷 PBS 中。
使用手术剪刀和镊子从气管表面去除血凝块和其他组织，并将它们切成一平方厘米的大小。在 37 摄氏度的蛋白酶溶液中孵育气管组织。40 分钟后，摇动试管数次，并使用 40 微米细胞过滤器去除剩余的组织。
在过滤器上用 5 毫升膨胀介质冲洗切碎的气管。在 4 摄氏度下以 400 G 离心气管悬液 5 分钟，然后将沉淀重悬于 8 毫升膨胀培养基中。使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞。
将 P0 细胞悬液接种在 100 毫米培养皿上，预涂有大鼠尾部胶原蛋白。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养细胞。
