澳大利亚核科学与工程学院的支持，是公认的事实。 TCK的是AINSE奖项的收件人。表观医学实验室是支持由国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会（566559）。这项工作是由“儿童权利公约”，生物医学成像发展有限公司，建立和下的澳大利亚政府S合作研究中心（CRC）计划的支持。 LM是由墨尔本研究所（墨尔本大学）和生物医学成像的华润补充奖学金支持。莫纳什显微成像（DRS斯蒂芬科迪ISKA卡迈克尔）的支持是这项工作的宝贵。

细胞制备<ol><li>人红白血病K562细胞生长在10％（V / V）饱和湿度5％的CO 2环境中的胎牛血清和20毫克/毫升的庆大霉素的RPMI - 1640补充介质在37 ° C。 </li><li>染色前约18小时，洗指数生长的细胞（5 × 10 5细胞/毫升是最优的）用磷酸盐缓冲液（PBS），悬浮在新媒体和返回到37 ° C，5％的CO 2。 </li><li>两次用PBS离心洗涤细胞，在5分钟的转速约1500，并重新悬浮在新鲜的媒体。 </li><li>计数细胞并调整细胞密度约为5 × 10 5细胞/ ml。 </li></ol>细胞可以算作一个自动化的方法（如过滤器的大小5至20微米之间的希森美康或库尔特计数器），或通过台盼蓝排除方法和血球。过量的细胞数（&gt; 800细胞/厘米2），可能会导致非均匀染色。 辐照和免疫荧光染色<ol><li> cytospin剪辑，过滤器卡和幻灯片的组装与适当的标签。 </li></ol>当装配cytospin仪器，确保漏斗过滤卡孔重合。 <ol start="2"><li>使细胞或γ-辐射或X射线（在这个例子中2Gy）。 </li></ol>为了防止在照射病灶的形成，为5至10分钟之前和期间照射细胞置于冰上。 以下照射细胞在37℃，5％的CO 2所需的时间（峰γH2AX水平的30分钟至1小时，在这个例子中的1小时）。 <ol start="3"><li>用冷PBS清洗细胞两次离心悬浮在新鲜PBS。 </li><li>在5分钟500转100到150μL的细胞悬液，免除到每个cytospin漏斗和自旋。 </li><li>从cytospins分隔的幻灯片，让细胞适度空气干燥约15分钟。 </li></ol>不要让细胞完全干燥细胞形态可能瓦解。 <ol start="6"><li>周围的细胞具有疏水笔绘制一个圆。 </li><li> 4％多聚甲醛在室温（RT）5分钟，修复细胞。 </li></ol>根据我们的经验，与多聚甲醛固定是优于乙醇或甲醇固定。悬浮细胞需要固定在室温下5分钟，而贴壁细胞的最佳固定需要较长的固定时间（15至20分钟）。 我们发现，染色立即产生更好的效果，比储存在-20 ° C，通常在高背景荧光固定的幻灯片。 <ol start="8"><li>用PBS清洗细胞两次，每次5分钟。 </li><li>通透细胞，用0.1％TRITON - X的RT 100 5分钟。 </li></ol>吐温80相比，我们通常观察与Triton X - 100通透细胞更好的信号。根据细胞类型，它可能需要改变的permeabilisation时间。例如，在K562细胞在室温下5分钟的通透性是足够的，而在15分钟的贴壁细胞通透需要。 <ol start="10"><li>洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。 </li><li>座在室温为30分钟（3 × 10分钟）的1％BSA的细胞。 </li></ol>我们比较使用血清（二级抗体的同一品种产生）和牛血清白蛋白的PBS阻断效率。 BSA是在最大限度地减少非特异性二次抗体结合更有效率相比，血清。我们比较了不同的阻断时间，一夜之间堵在4 ° C相比，3 × 10分钟和3 × 20分钟的阻塞在室温下的步骤，并确定为3 × 10分钟的阻塞是最佳的。 <ol start="12"><li>每张幻灯片添加50μL初级抗体（1：500 1％BSA稀释）。 </li></ol>孵育过夜抗体在室温为60分钟，结果减少背景染色的潜伏期比4 ° C。 <ol start="13"><li>染色不同的标记，同时使用在不同的物种（如鼠抗γH2AX和兔抗在这个例子中的甲基化H3K4）提出的抗体。 </li><li>在室温为90分钟，在250 RPM摇摆平台上小学抗体孵育。 </li></ol>所有孵化加湿染色槽。 <ol start="15"><li>洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。 </li><li>加入50μL（1：1000稀释在1％BSA）二级抗体，以每张幻灯片。 </li></ol>染色同一张幻灯片上的不同标记，使用二次抗体与Different种属特异性（抗体）和荧光发射波长（如抗鼠Alexa的488（绿色）和抗兔Alexa的- 546（红色）在这个例子中）。 <ol start="17"><li>在室温为60分钟，在250 RPM摇摆平台上培养的细胞。 </li></ol>建议在黑暗潮湿的会议厅，避免褪色和干燥的二级抗体孵育的细胞。 <ol start="18"><li>洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。 </li><li>每张幻灯片添加50μL（1:500 PBS稀释）TOPRO - 3。 </li><li> 3X 5分钟，用PBS冲洗幻灯片。 </li><li>从幻灯片中删除多余的水分和添加防褪色的解决方案。 </li></ol>这是建议，没有完全晾干后方可加入防褪色的解决方案的细胞。 <ol start="22"><li>盖玻片，指甲油密封和离开幻灯片在黑暗中过夜，在室温。 </li></ol>这是推荐使用的具体盖玻片焦＃1.5（0.16-19微米厚）和透明指甲油。 在幻灯片上放置盖玻片，应小心，以避免形成气泡。 图像采集<ol><li>蔡司LSM510元共聚焦显微镜是用来获取图像，使用标准GFP（绿色，488纳米），PI（红色543纳米）和远红光（蓝色633纳米）的激光。 </li></ol>图片收购，使用共聚焦显微镜，揭示了更好的空间分辨率。 由于γH2AX灶的大小可能会低于0.5μicrons，它是建议获得至少0.5μicron沿Z轴的步长大小的图像。 一个63 ×油浸物镜相比或高或低放大倍率是首选。对于成像许多灶计数细胞，最好是使用8个扫描速度和图像尺寸1024 × 1024像素。为了说明不同，它是建议使用2048 × 2048像素图像的大小为6扫描速度的核蛋白质的空间之间的关系。 当来自多个渠道的成像相比，一帧扫描线扫描收购建议。这就避免了漂白和更好的分辨率达到。顺序扫描是用来防止渠道之间的流血。 佛慈计数图像分析和灶计数，可以使用各种套装软件（计有Metamorph，图像- J和Imaris）。这里描述灶使用Metamorph计数程序。 <ol><li>无论是直接从文件菜单，或通过建立数堆栈选项打开γH2AX形象栈。 </li><li>转到进程“菜单，并选择堆栈算术。 </li><li>选择了最大的投影，选择要包含的飞机，并单击“确定”。 </li><li>保存作为γH2AXTIFF图像。文件，并打开TOPRO - 3（蓝色）的图像。 </li><li>进入的地区，选择一个区域的绘图工具画原子核周围的地区。 </li><li> γH2AXTIFF图像处理菜单，并选择形态滤波器。 </li><li>选择顶帽子，并选择γH2AX图像作为源图像。 </li><li>应用自顶帽子过滤器和由此产生的图像将是一个二进制图像灶强度，低噪音和减少变异。 </li></ol>顶帽子值时，应注意选择。最优值，可以得到图像的视觉对比前后应用过滤器。 <ol start="9"><li>前往处理菜单，并选择阈值图像。 </li><li>选择包容性阈值和选择较低和较高的阈值。 </li></ol>它通常是影响癌灶数目的阈值。因此，选择阈值时，需要十分重视。这可以最好地实现计数灶使用不同的阈值值在细胞暴露于γ辐射低于2 Gy的，然后比较与人工计数（眼），疫源地号码。最优阈值是一个最小化背景的包容性和最大限度地提高列入灶。 <ol start="11"><li>选择TOPRO - 3的形象和地区菜单，并选择转移地区选项。选择TOPRPO - 3的源图像和顶帽子的目标，并单击确定。 </li><li>一旦核地区转移到了顶帽子的形象去测量菜单，并选择综合形态计量学分析。 </li><li>在弹出窗口中选择源图像顶帽子和按面积的措施。 </li><li>选择测量上衡量各地区，各获得所有相应的核顶帽子的形象灶数量。 </li><li>疫源地从每个区域的数字可以被导出到一个MS - Excel文件，使用日志数据的选项。 </li></ol> 3D图像重建要创建一个三维图像，从使用Metamorph栈： <ol><li>转到堆栈菜单选择三维重建。 </li><li>选择旋转的角度（如160 °，320 °）。 </li><li>选择类型最大的三维重建。 </li><li>选择旋转平面（水平或垂直）。 </li><li>选择的Z -校准距离。 </li></ol>最好是使用用户指定的Z轴的距离（最佳为0.5μicrons）。 <ol start="6"><li>选择确定以创建一个三维重建。 </li></ol>线扫描分析对于线扫描分析，使用Metamorph： <ol><li>打开一个单一的平面图像或堆放文件。 </li><li>转到测量工具栏“命令，选择线扫描分​​析。 </li><li>整个单元格中画一条线，这将自动显示每个标记的荧光强度和距离沿行的路径。 </li></ol>为了澄清各种染色标记的空间关系，例如，γH2AX灶和组蛋白甲基化，这是可取的画线，跨越地区，都是密集的差，在这些标记。 具有代表性的数据对于这个演示的目的，我们利用抗体来γH2AX灶和H3K4me，双链断裂的空间分布来评价一个积极抄写常染色质的表观因素。如图1所示，与2Gy照射后γH2AX灶形成，主要为H3K4me染色和DNA染色TOPRO - 3（鲜艳染色的DNA区域指示异）沉闷的地区。 <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。γH2AX灶形式在常染色质主要在电离辐射。 （一）人红白血病K562细胞的免疫可视化γH2AX灶（绿色），1小时后，γ射线照射（2戈瑞）。 γH2AX灶有关H3K4me，代表积极抄写常染色质（红色）。 DNA标记TOPRO - 3（蓝色）。合并后的图像（蓝色，红色和绿色）演示了从排斥异色地区γH2AX灶。线扫描分析（荧光强度与距离）表示在一个平面上的标记相对分布。 （二）在不同的飞机从合并后的图像三维重建片上面所述。

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

早期的分子反应，DNA双链断裂（DSB的）磷酸化的SER - 139内的组蛋白H2AX 1,2终端SQEY图案的残留。 H2AX的磷酸化介导的磷脂，inosito 3 -激酶（PI3K）的蛋白质家族，共济失调毛细血管扩张症（ATM）的突变，DNA -蛋白激酶催化亚基，ATM和相关RAD3（ATR）的3。 H2AX的磷酸化形式，简称为γH2AX，蔓延到邻近地区的染色质的DSB网站，形成离散灶，很容易由3 immunofluorecence显微镜可视化。分析和定量γH2AX灶已被广泛用于评估DSB的形成和修复，特别是在电离辐射和评估各种修改化合物和细胞毒素化合物4辐射的功效， 。 鉴于这种双链断裂从头标志的精美的特异性和灵敏度，它在染色质中的DNA损伤和修复的过程提供新的见解。例如，在辐射生物学中心的范例是核DNA与放射敏感性的关键目标。事实上，在该领域的普遍共识在很大程度上被认为染色均匀的模板为DNA损伤与修复。然而，与γH2AX作为分子标记，DNA双链断裂，在γ射线照射，诱导γH2AX灶在常染色质和异染色质的形成悬殊的使用已被观察到5-7。最近，我们使用的抗体面板，无论是单，双或三甲基化组蛋白H3赖氨酸9（H3K9me1，H3K9me2，H3K9me3）后生印记构异染色质和转录沉默和赖氨酸4（H3K4me1，H3K4me2，H3K4me3 ），这是密切相关的积极抄写常染色质区域，调查γH2AX的空间分布， 电离辐射8。按照当时的想法，关于染色质生物学，我们的研究结果表明γH2AX的形成和活跃转录9之间的密切相关。在这里，我们展示了非贴壁细胞中γH2AX灶的检测和定量的免疫方法，特别注重与其他的表观遗传标记，图像分析和三维建模与合作本地化。

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Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

微观分析γH2AX灶，形成以下丝氨酸139磷酸化H2AX在DNA双链断裂，已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们使用一种抗体，单甲基化的组蛋白H3赖氨酸4作为一个积极抄写常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导γH2AX形成的细胞核内的空间分布。

评价以下电离辐射的空间分布的γH2AX

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K 次观看.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. 微观分析γH2AX灶，形成以下丝氨酸139磷酸化H2AX在DNA双链断裂，已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们使用一种抗体，单甲基化的组蛋白H3赖氨酸4作为一个积极抄写常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导γH2AX形成的细胞核内的空间分布。