El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). Este trabajo está financiado por el CRC de Imágenes Biomédicas Development Ltd, establecido y apoyado en los Centros del Gobierno de Australia s de Investigación Cooperativa (CRC). LM con el apoyo de Melbourne de Investigación (Universidad de Melbourne) y de Imágenes Biomédicas becas complementarias CRC. El apoyo de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody y Carmichael Iska) fue muy valiosa para este trabajo.

Preparación de células <ol><li> Eritroleucemia humana K562 células se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v / v) de suero fetal bovino y 20 mg de gentamicina / ml en un humidificado 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C. </li><li> Aproximadamente 18 horas antes de la tinción de las células en crecimiento exponencial de lavado (óptima a 5 x 10 5 células / ml) con tampón fosfato salino (PBS), se resuspenden en medio fresco y volver a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS por centrifugación a aproximadamente 1500 rpm durante 5 minutos y resuspender en medio fresco. </li><li> Recuento de células y ajustar la densidad celular de aproximadamente 5 x 10 5 células / ml. </li></ol> Las células se pueden contar, ya sea por un método automatizado (por ejemplo, Sysmex o Coulter contador con el tamaño del filtro de 5 a 20 micrones) o mediante el método de exclusión del azul tripano y un hemocitómetro. Exceso en el número de células (&gt; 800 células / cm 2) puede conducir a la no-uniforme manchado. La irradiación y la tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Montar clips citospina, tarjetas de filtro y se desliza con un etiquetado adecuado. </li></ol> Durante el montaje del aparato citospina asegurarse de que el agujero en la tarjeta del filtro coincide con el embudo. <ol start="2"><li> Exponer las células a cualquiera de γ-radiación o los rayos X (2Gy en este ejemplo). </li></ol> Para evitar la formación de focos durante la irradiación, mantener las células en hielo durante 5 a 10 minutos antes y durante la irradiación. Después de la irradiación se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante el tiempo necesario (para los niveles máximos de γH2AX 30 minutos a 1 hora, 1 hora en este ejemplo). <ol start="3"><li> Lavar las células dos veces con PBS frío mediante centrifugación y se resuspenden en PBS. </li><li> Prescindir de 100 a 150 l de la suspensión celular en cada embudo citospina y giran a 500 rpm durante 5 minutos. </li><li> Separar las diapositivas de cytospins y permitir que las células de aire moderadamente seco durante unos 15 minutos. </li></ol> No deje que se seque por completo las células de morfología celular puede desintegrarse. <ol start="6"><li> Dibuje un círculo alrededor de las células con una pluma hidrofóbicas. </li><li> Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA). </li></ol> En nuestra experiencia, la fijación con paraformaldehído es superior a la fijación con etanol o metanol. Células en suspensión exigen la fijación durante 5 minutos a temperatura ambiente, mientras más tiempo de fijación (15 a 20 minutos) son necesarios para la fijación óptima de las células adherentes. Nos encontramos con que la tinción de inmediato da mejores resultados que el almacenamiento de los portaobjetos fijados a -20 ° C, que por lo general los resultados de la fluorescencia de fondo elevado. <ol start="8"><li> Lavar las células dos veces con PBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Permeabilizar las células con 0,1% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li></ol> En comparación con Tween-80 que suelen observar mejor las señales en las células permeabilized con Triton X-100. Dependiendo del tipo de célula que puede ser necesario cambiar el tiempo de permeabilización. Por ejemplo, en la permeabilización de las células K562 durante 5 minutos a temperatura ambiente es suficiente, mientras que en las células adherentes una permeabilización de 15 minutos es necesario. <ol start="10"><li> Lavar las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Bloquear las células en el 1% de BSA durante 30 minutos (3 x 10 minutos) a temperatura ambiente. </li></ol> Se comparó la eficacia de bloquear el uso de suero (derivado de la misma especie que la secundaria de anticuerpos) y albúmina sérica bovina en PBS. BSA fue más eficiente en la reducción de la unión no específica de anticuerpos secundarios en comparación con el suero. Se compararon los diferentes tiempos de bloqueo, el bloqueo de la noche a 4 ° C en comparación con 3 x 10 minutos y 3 x 20 minutos pasos bloqueo a temperatura ambiente, y se determinó que el bloqueo de 3 x 10 minutos, fue óptimo. <ol start="12"><li> Añadir 50 l de anticuerpo primario (1: 500 diluido en BSA al 1%) para cada diapositiva. </li></ol> La incubación con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 60 minutos los resultados de la tinción de fondo reducido en comparación con una incubación durante la noche a 4 ° C. <ol start="13"><li> Para teñir los diferentes marcadores utilizan simultáneamente anticuerpos producidos en distintas especies (por ejemplo, ratón anti-γH2AX y conejo anti-metilado H3K4 en este ejemplo). </li><li> Incubar con anticuerpos primarios durante 90 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 250 rpm. </li></ol> Todas las incubaciones se realizan a través de una tinción humidificado. <ol start="15"><li> Lavar las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Añadir 50 l de (1: 1000 diluido en BSA al 1%) anticuerpo secundario para cada diapositiva. </li></ol> Para la tinción de los marcadores diferentes en la misma diapositiva secundaria de anticuerpos con el uso despecificidad de especie ifferent (de acuerdo con el anticuerpo primario) y la fluorescencia de onda de emisión (por ejemplo, anti-ratón Alexa 488 (verde) y anti-conejo Alexa-546 (rojo) en este ejemplo). <ol start="17"><li> Se incuban las células durante 60 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 250 rpm. </li></ol> Se recomienda para la incubación de las células en una cámara oscura húmeda para evitar la decoloración y el secado de la secundaria de anticuerpos. <ol start="18"><li> Lavar las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Añadir 50 l de (1:500 diluido en PBS) TOPRO-3 para cada diapositiva. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS durante 5 minutos 3 veces. </li><li> Retire el exceso de humedad a partir de diapositivas y añadir anti-fade solución. </li></ol> Se recomienda que no se seque completamente antes de añadir las células anti-fade solución. <ol start="22"><li> Cubreobjetos, sellado con laca de uñas y dejar diapositivas durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. </li></ol> Se recomienda el uso confocal cubreobjetos específico # 1.5 (0.16 a 19 micras de espesor) y esmalte de uñas transparente. Al colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos, se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. De adquisición de imágenes <ol><li> Un microscopio Zeiss LSM510 Meta confocal se utiliza para adquirir imágenes utilizando el estándar de buenas prácticas agrarias (verde, 488 nm), PI (rojo 543 nm) y el láser rojo lejano (azul 633 nm). </li></ol> Las imágenes obtenidas con un microscopio confocal muestran una mejor resolución espacial. Dado que el tamaño de γH2AX focos pueden ser inferiores a 0,5 μicrons, se recomienda la adquisición de imágenes con al menos un 0,5 tamaño de paso μicron a lo largo del eje Z. A 63 de aceite de inmersión x lente del objetivo se prefiere frente a cualquier aumento superior o inferior. Para las células de imagen de muchos focos de contar, es preferible utilizar una velocidad de escaneo de 8 y tamaño de imagen de 1024 x 1024 píxeles. Para ilustrar la relación espacial entre las diferentes proteínas nucleares que se recomienda utilizar una velocidad de escaneado de 6, con tamaño de imagen de 2048 x 2048 píxeles. Cuando la imagen de múltiples canales de adquisición de una línea de exploración se recomienda en comparación con un análisis del marco. Esto evita la decoloración y una mejor resolución se logra. El escaneo secuencial se utiliza para evitar sangrar por entre los canales. Focos de contar Análisis de imágenes y contando los focos se puede realizar utilizando diversos paquetes de software (inlcuyendo Metamorph, Image J y Imaris). El procedimiento para el recuento de los focos con Metamorph se describe aquí. <ol><li> Abrir γH2AX pilas imagen directamente desde el menú Archivo o mediante el número de construir pilas de opción. </li><li> Ir al menú de Procesos y optó por la aritmética de la pila. </li><li> Eligió proyección máxima y seleccionar los planos que se incluirán y haga clic en Aceptar. </li><li> Guardar la imagen resultante como Tiff γH2AX. archivo y abrir el TOPRO-3 (azul) de la imagen. </li><li> Ir a las regiones y seleccionar una herramienta de dibujo región y elaborar las regiones alrededor de los núcleos. </li><li> Haga clic en la imagen γH2AX Tiff y vaya al menú de proceso y seleccionar los filtros morfológicos. </li><li> Elija Top-Hat y seleccione la imagen γH2AX como una imagen de origen. </li><li> Aplicar Top-Hat de filtro y la imagen resultante será una imagen binaria con menos ruido y menor variación en la intensidad de los focos. </li></ol> Se debe tener cuidado al elegir los valores Top Hat. Los valores óptimos se pueden obtener mediante la comparación visual de las imágenes antes y después de la aplicación de filtros. <ol start="9"><li> Ir al menú de proceso y seleccionar la imagen del umbral. </li><li> Elija umbral incluyente y seleccionar los valores umbral inferior y superior. </li></ol> Es por lo general los valores de umbral que afectan a varios focos. Por lo tanto, se requiere mucha atención al elegir los valores de umbral. Esto puede lograrse mejor por el número de focos de contar con diferentes valores de umbral en las células expuestas a menos de 2 Gy de radiación γ-y luego comparar los números de los focos con el conteo manual (a ojo). El valor del umbral óptimo es el que reduce al mínimo la inclusión de antecedentes y maximiza la inclusión de los focos. <ol start="11"><li> Seleccione la imagen TOPRO-3 y vaya al menú de las regiones y seleccionar la opción de transferencia de las regiones. Seleccione la imagen de origen como TOPRPO-3 y el destino como sombrero de copa y haga clic en Aceptar. </li><li> Una vez que las regiones nucleares son transferidos a la imagen Top-Hat, vaya al menú de medida y seleccione Análisis Morfometría Integrada. </li><li> En la ventana emergente de selección de fuente de imagen-Top-Hat y medir por área. </li><li> Seleccione medida de todas las regiones y haga clic en medida para obtener el número de focos en todos los núcleos correspondientes a la imagen Top-Hat. </li><li> El número de focos de cada región se pueden exportar a un archivo de MS-Excel mediante el uso de la opción de registro de datos. </li></ol> 3Dreconstrucción de imágenes Para crear una imagen 3D a partir de una pila utilizando Metamorph: <ol><li> Ir al menú de pila y elegir la reconstrucción 3D. </li><li> Seleccionar el ángulo de rotación (por ejemplo, 160 °, 320 °). </li><li> Seleccione la reconstrucción 3D de tipo máximo. </li><li> Eligió el plano de rotación (horizontal o vertical). </li><li> Elija la distancia Z-calibración. </li></ol> Es preferible utilizar el usuario especificado Z-distancia (óptima es de 0,5 μicrons). <ol start="6"><li> Elija Aceptar para crear una reconstrucción en 3D. </li></ol> Línea de análisis de seguridad Para el análisis de línea de exploración utilizando Metamorph: <ol><li> Abra una imagen en un solo plano o un archivo de apilado. </li><li> Ir a la herramienta de medida de barras de comandos y seleccione el análisis de línea de exploración. </li><li> Dibuja una línea a través de la célula y esto automáticamente va a revelar la intensidad de la fluorescencia y la distancia de cada marcador a lo largo de la trayectoria de la línea. </li></ol> Para dilucidar la relación espacial de los marcadores de la cromatina diferentes, por ejemplo, γH2AX focos y metilación de las histonas, es preferible para dibujar líneas que abarcan las regiones que son densos y pobres en estos marcadores. Los datos representativos Con el propósito de esta demostración se utilizó anticuerpos para γH2AX focos y H3K4me, para evaluar la distribución espacial de DSBs a un determinante epigenético de forma activa la transcripción de la eucromatina. Como se muestra en la figura 1, después de la irradiación con 2Gy, γH2AX focos formado sobre todo en regiones que estaban aburridos de tanto tinción H3K4me y de la mancha de ADN TOPRO-3 (regiones brillantes manchas de ADN son indicativos de la heterocromatina). <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. ΓH2AX focos forma predominante en la eucromatina en respuesta a la radiación ionizante. (A) de visualización de inmunofluorescencia γH2AX focos (verde) en humanos eritroleucemia K562 células, una hora después de la γ-irradiación (2 Gy). γH2AX focos se muestran en relación con H3K4me, lo que representa activamente a la transcripción de eucromatina (rojo). ADN está marcado con TOPRO-3 (azul). La imagen combinada (azul, rojo y verde), demuestra la exclusión γH2AX focos de las regiones de heterocromatina. El análisis de escaneo en línea (distancia de fluorescencia vs intensidad) se indica la distribución relativa de los marcadores en un solo plano. (B) Sectores en diferentes planos de la reconstrucción en 3D de la imagen fusionada se ha descrito anteriormente.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

Una primera respuesta molecular a roturas en el ADN de doble cadena (DSB) es la fosforilación de la Ser-139 de residuos en el motivo SQEY terminal de la histona H2AX 1,2. Esta fosforilación de H2AX está mediada por la fosfatidil-inosito 3-quinasa (PI3K), la familia de las proteínas, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), el ADN-proteína de la subunidad catalítica y la quinasa ATM y RAD3 relacionadas con 3 (ATR). La forma fosforilada de H2AX, conocido como γH2AX, se extiende a las regiones adyacentes de la cromatina en el sitio del OSD, la formación de focos discretos, que son fácilmente visualizados por microscopía immunofluorecence 3. Análisis y cuantificación de γH2AX focos ha sido ampliamente utilizada para evaluar la formación de OSD y la reparación, en particular en respuesta a la radiación ionizante y para la evaluación de la eficacia de la radiación y varios compuestos de la modificación de los compuestos citotóxicos 4. Dada la especificidad y la sensibilidad exquisita de este marcador de novo de DSBs, ha proporcionado nuevos conocimientos sobre los procesos de daño y reparación del ADN en el contexto de la cromatina. Por ejemplo, en biología de la radiación del paradigma central es que el ADN nuclear es el objetivo fundamental con respecto a la sensibilidad a la radiación. De hecho, el consenso general en el campo ha sido en gran parte para ver la cromatina como un modelo homogéneo de los daños y reparación del ADN. Sin embargo, con el uso de γH2AX como marcador molecular de DSBs, una disparidad en γ-inducida por irradiación formación γH2AX focos en la eucromatina y heterocromatina se ha observado 5-7. Recientemente, hemos utilizado un panel de anticuerpos para cualquier mono-, di-o tri-metilación de histonas H3 en la lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) que se imprime epigenética de la heterocromatina constitutiva y silenciamiento transcripcional y la lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), que están estrechamente correlacionados activa la transcripción de las regiones eucromática, para investigar la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes 8. De acuerdo con las ideas dominantes sobre la biología de la cromatina, nuestros resultados indican una estrecha correlación entre la formación de γH2AX y activa la transcripción 9. Aquí demostramos nuestro método de inmunofluorescencia para la detección y cuantificación de γH2AX focos en las células no adherentes, con especial hincapié en la co-localización con otros marcadores epigenéticos, análisis de imágenes y modelos 3D.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

El análisis microscópico de γH2AX focos, que forman después de la fosforilación de H2AX en la Ser-139 en respuesta a ADN de doble filamento se rompe, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí hemos utilizado un anticuerpo mono-metílico de la histona H3 lisina 4 como marcador epigenético de la eucromatina activa la transcripción, para evaluar la distribución espacial de la radiación inducida por la formación de γH2AX dentro del núcleo.

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K vistas.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. El análisis microscópico de γH2AX focos, que forman después de la fosforilación de H2AX en la Ser-139 en respuesta a ADN de doble filamento se rompe, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí hemos utilizado un anticuerpo mono-metílico de la histona H3 lisina 4 como marcador epigenético de la eucromatina activa la transcripción, para evaluar la distribución espacial de la radiación inducida por la formación de γH...

Video: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Investigación

Biología

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

El método de cultivo de la rebanada por Siguiendo desarrollo de gérmenes de dientes en Explante Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Análisis de SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Y el tráfico en las células humanas

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

El uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging entero de órganos y de tejidos Histología cuantitativa para determinar la bio-distribución de las moléculas marcadas con fluorescencia

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Cuantificación de lípidos abundancia y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nilo rojo y aceite rojo O manchas

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

Dosimetría para irradiación celular mediante instalaciones de rayos X de ortovoltaje (40-300 kV)

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...