התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). עבודה זו ממומנת על ידי ה-CRC עבור ביו הדמיה ופיתוח בע&quot;מ, הוקמה ונתמכת תחת מרכזי שיתופית של ממשלת אוסטרליה מחקר (CRC) בתוכנית. LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד&quot;ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו.

תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האדם erythroleukemic K562 התאים גדלים בינוני 1640 RPMI בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל גנטמיצין בסביבה humidified 5% CO 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 18 שעות לפני מכתים לשטוף התאים גדל באופן אקספוננציאלי (אופטימלי בבית 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל) עם פוספט בופר סליין (PBS), resuspend בתקשורת צח ולחזור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד כ 1500 למשך 5 דקות resuspend בתקשורת טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ולהתאים את צפיפות התאים של כ 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> תאים ניתן לספור באמצעות שיטה אוטומטית (למשל Sysmex או קולטר דלפק עם גודל מסנן בין 5 עד 20 מיקרון) או באמצעות השיטה trypan הדרה כחולה haemocytometer. מספר עודף של תאים (&gt; 800 תאים / ס&quot;מ 2) עלול להוביל מכתים לא אחידה. הקרנת והכתים immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב קליפים cytospin, כרטיסי לסנן שקופיות עם תיוג מתאים. </li></ol> כאשר הרכבת המנגנון cytospin להבטיח את החור כרטיס עולה בקנה אחד עם מסנן המשפך. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפת תאים לקרינת-γ או קרני רנטגן (2Gy בדוגמה זו). </li></ol> כדי למנוע היווצרות של מוקדי במהלך הקרנה, לשמור על התאים על קרח למשך 5 עד 10 דקות לפני ובמהלך ההקרנה. הקרנה לאחר דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור הזמן הנדרש (עבור רמות השיא γH2AX 30 דקות עד 1 שעה, 1 שעה בדוגמה זו). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם קר PBS על ידי צנטריפוגה ו resuspend ב PBS טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 100-150 μL ההשעיה התא לתוך משפך כל cytospin ספין ב 500 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את השקופיות cytospins ולאפשר לתאים אוויר יבש בינוני למשך כ 15 דקות. </li></ol> אל תתנו תאים יבשים לחלוטין כמו מורפולוגיה הסלולר עלול להתפורר. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר עיגול סביב התאים עם עט הידרופובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם paraformaldehyde 4% במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). </li></ol> מניסיוננו, קיבוע עם paraformaldehyde עדיפה על תיקון עם אתנול או מתנול. תאים השעיה דורשים קיבוע במשך 5 דקות ב RT בעוד פעמים קיבעון יותר (15 עד 20 דקות) יש צורך קיבעון אופטימלי של תאים חסיד. אנו מוצאים כי מיד מכתים מניבה תוצאות טובות יותר מאשר לאחסן את השקופיות קבוע ב -20 ° C, אשר בדרך כלל התוצאות הקרינה רקע גבוה. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים עם 0.1% Triton X-100 ב RT במשך 5 דקות. </li></ol> בהשוואה Tween-80 אנחנו בדרך כלל רואים טוב יותר אותות בתאי permeabilized עם טריטון X-100. בהתאם לסוג תא זה עשוי להיות נחוץ כדי לשנות את זמן permeabilisation. לדוגמה, K562 תאים permeabilization במשך 5 דקות ב RT מספיק ואילו בתאים חסיד permeabilization 15 דקות נדרש. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק תאים BSA 1% למשך דקה 30 (3 x 10 דקות) ב RT. </li></ol> החוקרים השוו את היעילות באמצעות חסימת בסרום (הנגזרות מאותו המין כמו נוגדנים משני) ו בסרום שור אלבומין PBS. BSA היה יעיל יותר לצמצום אי - מחייב של נוגדנים ספציפיים משנית לעומת בסרום. השווינו פעמים חסימה שונות, לילה חוסמים בשעה 4 ° C לעומת 3 x 10 דקות ו - 3 x 20 צעדים חסימת דקות בטמפרטורת החדר, וקבע כי חסימת עבור 3 x 10 דקות היה אופטימלי. <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של הנוגדן הראשוני (1: 500 בדילול של 1% BSA) על כל שקופית. </li></ol> דגירה עם נוגדן ראשוני ב RT במשך 60 דקות התוצאות מכתים רקע מופחת לעומת הדגירה לילה בשעה 4 ° C. <ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים סמנים שונים בו זמנית להשתמש נוגדנים וגדל מינים שונים (לדוגמא אנטי γH2AX ו הארנב עכבר אנטי מפוגל H3K4 בדוגמה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים העיקרי עבור 90 דקות RT על פלטפורמת נדנדה ב 250 סל&quot;ד. </li></ol> Incubations כל מבוצעות שוקת מכתים humidified. <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של (1: 1000 מדולל BSA 1%) נוגדנים משני כל שקופית. </li></ol> כדי כתם על סמנים שונים בשקופית אותו להשתמש נוגדנים משני עם דמינים ifferent סגוליות (על פי הנוגדן הראשוני) ואת פליטת הקרינה באורך גל (למשל אנטי עכבר Alexa 488 (ירוק) ואנטי ארנב Alexa-546 (אדום) בדוגמה זו). <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 60 דקות RT על פלטפורמת נדנדה ב 250 סל&quot;ד. </li></ol> מומלץ דגירה התאים בתא חשוך ולח, כדי למנוע דהייה וייבוש של נוגדן המשני. <ol start="18" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של (1:500 מדולל PBS) TOPRO-3 כדי שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות עם PBS במשך 5 דקות 3X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחות עודפת משקופיות ולהוסיף אנטי לדעוך פתרון. </li></ol> מומלץ לא לייבש התאים לחלוטין לפני הוספת אנטי לדעוך פתרון. <ol start="22" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip, חותם עם לכה מסמר לעזוב שקופיות לילה בחושך בטמפרטורת החדר. </li></ol> מומלץ להשתמש coverslips ספציפי confocal # 1.5 (0.16-19 מיקרון עבה) ו לק ברור. בעוד הנחת coverslip בשקופית, יש להיזהר כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. תמונה הרכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ LSM510 Zeiss Meta Confocal משמש לרכוש תמונות באמצעות ה-GFP רגיל (ירוק, 488 ננומטר), PI (אדום 543 ננומטר) לייזרים אדום רחוק (כחול 633 ננומטר). </li></ol> תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ confocal לחשוף ברזולוציה מרחבית טובה יותר. מאז בגודל של γH2AX מוקדי עשוי להיות נמוך מ -0.5 μicrons, מומלץ לרכוש תמונות עם לפחות בגודל 0.5 μicron צעד לאורך ציר Z-. 63 טבילה x שמן העדשה המטרה היא המועדפת לעומת הגדלה או גבוה או נמוך יותר. עבור תאים הדמיה רבים עבור מוקדי לספור עדיף להשתמש במהירות סריקה של 8 וגודל תמונה של 1024 x 1024 פיקסלים. כדי להמחיש את הקשר המרחבי בין חלבונים שונים גרעיני מומלץ להשתמש מהירות סריקה של 6 עם גודל תמונה של 2048 x 2048 פיקסלים. כאשר הדמיה של ערוצים מרובים הרכישה סריקה קו מומלץ לעומת סריקה מסגרת. זה ימנע הלבנת רזולוציה גבוהה יותר מושגת. סריקה סדרתית משמש כדי למנוע דימום דרך בין ערוצים. מוקדים לספור ניתוח תמונה והספירה מוקדים יכול להתבצע באמצעות חבילות תוכנה שונות (inlcuding Metamorph, Image-J ו Imaris). נוהל ספירת מוקדים באמצעות Metamorph מתואר כאן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח γH2AX ערימות התמונה ישירות מתפריט קובץ או באמצעות האפשרות לבנות מספר ערימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תהליך התפריט ובחרו חשבון מחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו הקרנה מקסימלי ובחר את המטוסים להיכלל ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונה והתוצאה כמו Tiff γH2AX. קובץ ופתח את TOPRO-3 (כחול) התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אזורים לבחור כלי ציור האזור לצייר אזורים סביב גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התמונה Tiff γH2AX ועבור אל תפריט תהליך ובחר מסננים מורפולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו Top-Hat ובחר תמונה γH2AX כתמונת המקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל Top-Hat לסנן התמונה המתקבלת תהיה תמונה בינארית עם פחות רעש וגם וריאציה מופחתת בעוצמה מוקדים. </li></ol> יש להקפיד בבחירת Top-Hat ערכים. ערכים אופטימליים ניתן להשיג על ידי השוואה ויזואלית של תמונות לפני ואחרי החלת מסננים. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל תפריט תהליך ובחר תמונה הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סף כולל ובחר את ערכי הסף נמוך יותר. </li></ol> זה בדרך כלל ערכי הסף המשפיעים מספר מוקדים. לכן, נדרשת תשומת לב רבה בעת בחירת ערכי הסף. זו יכולה להיות מושגת הטובה ביותר במספר מוקדים לספור באמצעות ערכי סף שונים בתאים שנחשפו נמוך מ 2 Gy של קרינה γ ולאחר מכן השווה מספרים מוקדים עם ספירה ידנית (לפי העין). ערך הסף האופטימלי הוא זה ממזער את הכללת הרקע למקסימום הכללת מוקדים. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התמונה TOPRO-3 ועבור אל תפריט האזורים ובחר באפשרות העברת אזורים. בחר את מקור התמונה כפי TOPRPO-3 ו - היעד כפי-Top Hat ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע האזורים הגרעין מועברים תמונה Top-Hat ללכת לתפריט למדוד ולבחור Morphometry ניתוח משולב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב מוקפץ מקור לבחור חלון תמונה Hat-Top ולמדוד לפי אזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר למדוד כל האזורים ולחץ על אמצעי כדי להשיג את מספר מוקדים בכל גרעינים המקביל תמונה Top-Hat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המספרים מוקדים מאזור זה ניתן לייצא לתוך קובץ MS-Excel באמצעות האפשרות יומן נתונים. </li></ol> 3Dשחזור של תמונות כדי ליצור תמונת 3D מתוך ערימה באמצעות Metamorph: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל תפריט מחסנית ולבחור מחדש 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את זווית הסיבוב (למשל 160 °, 320 °). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג השיקום 3D-מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו את המטוס של הסיבוב (אופקי או אנכי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו את המרחק Z-כיול. </li></ol> עדיף להשתמש המשתמש שצוין Z-מרחק (האופטימלי הוא 0.5 μicrons). <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו אישור כדי ליצור שחזור 3D. </li></ol> הקו ניתוח לסרוק ניתוח קו סריקה באמצעות Metamorph: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח או תמונה מטוס בודד או קובץ מוערמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפקודה כלי למדוד ברים לבחור סריקה וניתוח קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר קו על פני התא הזה באופן אוטומטי לחשוף את עוצמת הקרינה במרחק של סמן אחד לאורך הנתיב של הקו. </li></ol> כדי להבהיר את היחס המרחבי של הכרומטין סמנים שונים, למשל, γH2AX מוקדים ו מתילציה היסטון, עדיף לצייר קווים אשר תוחלת אזורים כי הן צפופים ועניים סמנים אלה. נציג נתונים לצורך הפגנה זו השתמשנו נוגדנים γH2AX מוקדים כדי H3K4me, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של DSBs כדי הקובע epigenetic של פעיל לתעתוק euchromatin. כפי שמוצג בתרשים 1, בעקבות הקרנה עם 2Gy, נוצר γH2AX מוקדים בעיקר באזורים שהיו משעמם עבור מכתים הן H3K4me ועל ה-DNA כתם TOPRO-3 (אזורים בהירים DNA מוכתם מעידים על heterochromatin). <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ΓH2AX מוקדים טופס בעיקר euchromatin בתגובה לקרינה מייננת. (א) ויזואליזציה של immunofluorescence γH2AX מוקדים (ירוק) ב K562 תאים אנושיים erythroleukemic, 1 שעה לאחר ההקרנה-γ (2 Gy). γH2AX מוקדים מוצגים ביחס H3K4me, המייצג באופן פעיל לתעתוק euchromatin (אדום). DNA הוא תווית עם TOPRO-3 (כחול). התמונה הממוזגת (כחול, אדום וירוק) מדגים את הדרה γH2AX מוקדים מאזורים heterochromatic. קו סריקה וניתוח (לעומת עוצמת הקרינה למרחק) מציין את ההפצה היחסית של סמנים במטוס אחד. (ב) פרוסות על המטוסים שונה לשחזור 3D של התמונה הממוזג שתוארו לעיל.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

תגובה מולקולרית מוקדם הדנ&quot;א הכפול גדיל הפסקות (DSBs) הוא זירחון של שאריות סר 139-מוטיב בתוך הטרמינל SQEY של 1,2 H2AX היסטון. זירחון זה של H2AX מתווכת על ידי phosphatidyl inosito-3-kinase (PI3K) משפחה של חלבונים, אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM), ה-DNA למקטע החלבון קינאז קטליטי ATM ו RAD3 הקשורות (ATR) 3. צורת פוספורילציה של H2AX, המכונה γH2AX, מתפשט לאזורים סמוכים של הכרומטין מהאתר של DSB, ויוצרים מוקדים נפרדים, שהם דמיינו בקלות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorecence 3. ניתוח quantitation של γH2AX מוקדים כבר בשימוש נרחב על מנת להעריך היווצרות DSB ותיקון, בעיקר בתגובה לקרינה מייננת ו להערכת היעילות של קרינה שונים שינוי תרכובות תרכובות ציטוטוקסיות 4. לאור רגישות וספציפיות מעולה של סמן זה דה נובו של DSBs, זה סיפק תובנות חדשות על תהליכים של נזק לדנ&quot;א ותיקון בהקשר של הכרומטין. לדוגמה, ביולוגיה קרינה הפרדיגמה המרכזית היא כי ה-DNA גרעיני היא מטרה קריטית לגבי רגישות לקרינה. ואכן, הסכמה כללית בתחום כבר במידה רבה כדי להציג הכרומטין כתבנית הומוגנית עבור נזק לדנ&quot;א ותיקון. אולם, עם השימוש γH2AX כסמן המולקולרי של DSBs, פער γ-קרינה-Induced היווצרות מוקדים γH2AX ב euchromatin ו heterochromatin נצפתה 5-7. לאחרונה, השתמשנו פאנל של נוגדנים או מונו, די או תלת מפוגל היסטון H3 ב ליזין 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) אשר טביעות epigenetic של heterochromatin המכונן ועל ההשתקה תעתיק וליזין 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), אשר מתואמים היטב פעיל לתעתוק euchromatic האזורים, כדי לחקור את הפריסה המרחבית של γH2AX בעקבות קרינה מייננת 8. בהתאם לרעיונות הרווחת לגבי ביולוגיה הכרומטין, הממצאים שלנו מצביעים על קשר הדוק בין היווצרות γH2AX ו שעתוק פעיל 9. כאן אנו להדגים שיטה immunofluorescence שלנו עבור איתור quantitation של γH2AX מוקדים שאינם חסיד תאים, עם דגש מיוחד על שיתוף לוקליזציה עם סמנים epigenetic אחרים, ניתוח תמונה-3D דוגמנות.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Spatial Distribution of Î³H2AX following Ionizing Radiation at JoVE.com

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ&quot;א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX קרינה הנגרמת בתוך הגרעין.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K Views.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ"א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX ...

Video: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

ניתוח של SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation וסחר בבני אדם תאים

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

דוזימטריה עבור הקרנת תאים באמצעות Orthovoltage (40-300 kV) מתקני רנטגן

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

קביעת הרעילות של קרינת UV וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...