无激光羟基基蛋白足迹，对蛋白质进行更高级的结构分析

无激光羟基基蛋白足迹使识别蛋白质相互作用点和确认变化区域更加容易，加速了蛋白质聚合、结构和稳定性研究。通过内联基度量程，用户可以实时调整有效的羟基基负荷，使用实时基度文量计，可以节省实验时间和珍贵的样品，同时提高标签的可重复性。首先，用硅裂石将250微米内径的二氧化硅毛细细丝切成27英寸，检查毛细金的末端是否干净而直切。

创建两个长度约 15 毫米的窗口。从毛细管的下端，烧掉聚酰胺涂层 90 毫米，以创建光解窗口和 225 毫米的多厘米窗口。插入毛细细纸的下端，正好超过螺母和铁杉的圆锥端。

将毛细金加入第五端口，用扳手紧贴手指。通过将其直接拉出，取出光解模块的光解单元盖，然后取出磁性安装的金属面膜，该面膜将保持毛细细线到位。通过按下左边的标签打开圆分细胞，并将圆圆体单元向右摆动。

取出磁性安装的夹子，将毛细细毛放在原位。然后将毛细细金银放入光解单元底部的凹槽通道中，并将毛细细金银窗与光解细胞窗口对中心。将毛细细毛放在位，并添加磁性面膜。

将照片分析盖放回原位。将毛细管放入圆分细胞底部的凹槽通道中，并将第二个毛细管窗口放在多厘米细胞中心的小孔径上。一手握住毛细细毛，一手将两个磁性夹子放在原位，将毛细细毛放在原位。

关闭多米细胞，直到它点击关闭。最后，将毛细金插入产品收集器毛细的扶手上方的刀尖旋钮，将毛细条延伸到小瓶底部的正上方。使用切割机切割所需的特氟隆管长度，并检查末端是否有干净的直切。

通过其中一个螺母插入新注射回路的一端，并将新的铁杉放在管子的末端。将螺母和铁杉放在原位，同时将管插入注水阀的端口六，直到其底部。用扳手拧紧螺母，然后确认螺母和铁杉牢固到位。

一旦两端有一个螺母和固定的铁杉，松散地拧一端到端口三和另一端端。一旦到位，拧紧两侧手指紧，然后四分之一转过去手指紧用扳手。启动流体模块，打开无激光HRPF系统，然后是光解模块、圆圆模块、产品收集器和系统计算机。

启动系统软件。从注射器泵上的阀门位置将管子完全浸入 10 毫升缓冲器中。将管子从废品位置和管子从注射器端口上的二号港引导到一个空容器中收集废物。

将 1.5 毫升微中流管放置在产品收集器旋转木马上标有 HN6 的位置。通过注入 25 微升 HPLC 级水，将阀门设置在负载位置，五次冲洗出喷射回路。手动转动喷射阀以冲洗系统其余部分。

选择控制软件上的进程，开始流动水，直到水滴形成。制作含有两毫升腺苷和10微摩尔蛋白的溶液。然后使用每毫升卡塔拉塞0.3毫克和35毫摩尔甲基安氨酸做淬淬溶液。

将 25 微升淬淬的溶液放入 200 微升微管中。将过氧化氢稀释到200毫升，将其保持在冰上。在控制软件上以零伏启动闪光电压。

这种零伏控制将决定兴趣蛋白的任何背景氧化。选择启动数据自动零，然后进行进程然后准备。最后，将喷射阀调低至负载位置。

将淬泄解决方案放在产品收集器旋转木马上的位置，然后将产品小瓶更改为系统控制软件上的小瓶。注射前，将12.5微升腺苷和蛋白质混合物与12.5微升过氧化氢混合。将混合物上下混合，然后快速旋转下来。

混合后10秒内使用注射端口注射25微升溶液。将注射阀切换到注射位置，并在处理样品时等待。将控制软件上的闪光电压调高至 750 伏特，并重复标记步骤。

然后记录每个样本的吸收度。首先，单击"选择"，然后手动选择峰值吸收的开始和结束。在可用空间中，写入示例的描述。

对于所有已获得的数据，重复此步骤。将数据复制并粘贴到电子表格中，以计算每个电压腺苷吸收量的平均变化。采集完所有样品后，将注射阀设置为负载位置，将注射阀和样品循环冲出，并注射 25 微升 HPLC 水五次。

将注射阀调至喷射位置，用 HPLC 水冲洗系统其余部分。冲洗后，停止流量，退出系统控制软件，并关闭模块，从产品收集器、圆圆模块、光解模块开始，最后是流体模块。氧化后，用于量程的腺苷在265纳米时会降低紫外线吸收量。

缓冲区 2 包含一个激进的清理剂，与缓冲区 1 相比，它减少了腺苷吸收的变化。在四个增加的等离子灯电压下，在过氧化氢和腺苷的存在下，对阿波米奥球蛋白进行了改良。检测到六个肽，氧化的线性增加，在265纳米的腺苷吸收变化。

这六种氧化肽被标记在肌红蛋白的晶体结构上。从高压等离子灯检测到的氧化程度远远高于激光法。这种增加源于高压等离子灯的广谱紫外线发射光谱。

与Kr F Excimer激光和Nd YAG激光相比，高压等离子灯通过产生宽广的紫外光谱，更好地重叠过氧化氢的吸收域，从而通过过氧化氢的光解更有效地生产羟基。高压等离子灯显著提高了羟基基的产量，超过了通常使用 Kr F Excimer 激光观察到的产量。使用100毫摩尔过氧化物可引起高水平的背景氧化。

如果蛋白质系统容易受到过氧化物引起的氧化，将浓度降低到10毫升。HRPF 的不可逆标签允许下游样品处理，包括长蛋白酶消化，您可以添加串联质量标签进行多重处理，并执行 2D 色谱，所有这些都可改善肽检测和协调结构信息。