这项工作是由德国研究基金会（DFG; LU1455/1-1）的资助支持。

1。 前大毛文化<ol><li>在强制通风孵化器（BSS160，Ehret，德国）在37.5°C间新鲜受精卵奠定孵化湿度60％到他们的长边。在12°C储存时间超过一个星期的鸡蛋不应使用。 </li><li> 2.5天（约阶段HH17）孵化后，取出鸡蛋和标签顶端，用铅笔表明开裂方向。 </li><li>在打击之前，倒入一个干净的大培养皿（直径145毫米;格雷纳生物公司之一，德国），约20毫升无菌蒸馏水。 </li><li>到大培养皿中，将另一个小的无菌培养皿（直径94毫米;​​格​​雷纳生物一公司）。 </li><li>对锋利的金属边缘的底部裂缝的鸡蛋，小心翼翼地打开鸡蛋和小培养皿转移到每个鸡蛋的整个内容。 </li><li>大培养皿盖上盖，投入另一个孵化器（粘合剂有限公司，Tuttlinge，德国）为进一步培养在37.5℃，湿度60％左右。胚胎孵化所需的天数后，可用于电。 </li></ol> 2。 前OVO电穿孔的制备<ol><li>拉玻璃毛细管与电极拔（普勒100微管拖轮;世界精密仪器，柏林，德国）使用玻璃管直径1.0毫米（TW100F-4;世界精密仪器），并打破玻璃毛细管到一个合适的一角直径。 </li><li>设置适当的参数（即，为不同组织和胚胎的大小不同的电压）为电和电极连接到一个electroporator（编辑; CUY21-NEPA基因，千叶，日本），根据靶组织和胚胎的大小。 </li><li>准备含有质粒pCAGGS载体靶基因编码，例如，cadherin7（Cad7; pCAGGS-Cad7浓度为2.0微克/微升）和标记基因质粒的解决方案，例如，绿色荧光蛋白（GFP; pCAGGS-GFP的浓度为0.25微克/微升）。再加入终浓度为0.1％（Sigma公司）绿色标签质粒的解决方案的快速绿色。 </li><li>加载玻璃毛细管质粒用口吸管的解决方案。 </li></ol> 3。由前大毛电穿孔基因转移到鸡顶盖<ol><li>经过前大毛文化，例如，通过孵化日（五）6，鸡胚胎用于前大毛电。 </li><li>仔细在顶盖撕裂卵黄和羊膜膜用细镊子和顶盖表面添加无菌0.9％氯化钠溶液3滴。 </li><li>由玻璃注入质粒的解决方案，用口吸管毛细血管到顶盖腔。 </li><li>放置电极，钨针阴极和旁边顶盖矩形板阳极（CUY 661-3x7，NEPA基因），立即申请的顶盖electroporator所产生的电脉冲（6脉冲，25V，60毫秒脉冲长度，每个案件100毫秒间隔）。 </li><li>覆盖的大型培养皿的盖子，并返回进入孵化器。适当天（例如，电击后2天或3天）的潜伏期后，顶盖的收集和固定染色（ 图1）和生物检测。 </li></ol> 4。代表结果成功由前大毛电Cad7和绿色荧光蛋白的外源蛋白的过度表达作为一个例子，在图1所示。当Cad7与GFP质粒质粒一起到顶盖电穿孔的E6电后，两三天内，胚胎收集和固定。在E8的，强烈表达绿色荧光蛋白在整个安装图像（ 图1A-C），顶盖。此外，在九个人口众多的顶盖部分，绿色荧光蛋白（ 图1D绿色）和Cad7蛋白（ 图1E红色）共表达（ 图1F黄色），这表明前大毛电是一个成功的基因转移到鸡胚胎在体内的旧方法。 <img src="/files/ftp_upload/4078/4078fig1.jpg" alt="图1"/> 图1。当质粒编码绿色荧光蛋白和Cad7的E6转染鸡顶盖， 前大毛电后两三天，绿色荧光蛋白（绿色）强烈表达（交流）wholemount的图像显示在E8的。在九个人口众多的顶盖部分，绿色荧光蛋白（D中的绿色）和Cad7蛋白（红色在E）共表达（在F黄色）。高炉，亮场图像。比例尺：在一个200微米交流;为DF在D 100微米。

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	<li>Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-20+expression+by+motor+neurons+is+regulated+by+Sonic+hedgehog+during+spinal+cord+development.">Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development.</a> NeuroReport. 20, 365-370 (2009).</li><li>Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalized+cadherin-7+expression+by+radial+glia+is+regulated+by+Shh+and+Pax7+during+chicken+spinal+cord+development.">Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development.</a> Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+targeted+silencing+of+developmental+control+genes+during+chicken+embryogenesis.">RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis.</a> Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).</li><li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo.">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).</li><li>Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+introducing+morpholinos+into+the+chicken+embryo.">Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo.</a> Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).</li><li>Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherins+guide+migrating+Purkinje+cells+to+specific+parasagittal+domains+during+cerebellar+development.">Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development.</a> Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).</li><li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos.">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).</li><li>Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+axons+to+specific+fiber+tracts+in+vivo+by+altering+cadherin+expression.">Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression.</a> J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

该协议提供了旧鸡胚前OVO电（例如，将在E6顶盖）的转基因指南。这种方法延长使用电老鸡胚胎，并在稍后阶段研究基因在体内的功能可以方便地应用于许多实验室。至少从E4类E7的胚胎可以用这种方法成功的电穿孔和电穿孔胚胎可以存活直到E15 11。除了 ​​大脑，这种方法还可以用于基因转移成鸡肢体制度11。 应特别注意支付给由前OVO电?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td></tr><tr><td> electroporator </td><td>日本NEPA基因， </td><td> CUY21的编辑</td></tr><tr><td>电极</td><td>日本NEPA基因， </td><td> CUY661-3x7 </td></tr><tr><td>鸡蛋孵化器</td><td> ehret，德国</td><td> BSS160 </td></tr><tr><td>胚胎孵化器</td><td>粘合剂有限公司，德国</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td> KEYENCE，德国公司</td><td> BZ-8000 </td></tr><tr><td>培养皿</td><td>格雷纳生物，其中有限责任公司，德国</td><td></td></tr><tr><td>微电极拔</td><td>世界精密仪器，德国</td><td>的Pul-100 </td></tr></tbody></table>

gene transfer into older chicken embryos by ex ovo electroporation

鸡胚胎为研究胚胎发育过程中基因功能和调控提供了一个很好的模型系统。 在OVO电是一个强大的过度表达外源基因的方法或下调体内的内源性基因在鸡胚1。不同的结构，如DNA质粒编码基因的小干扰RNA（siRNA）的质粒5，小合成的RNA寡核苷酸6，和吗啉反义寡核苷酸7 2-4，可以很容易地通过电转染鸡胚胎。然而， 在OVO电的应用是有限的胚胎早期孵化阶段（年龄小于阶段HH20 -据汉堡和汉密尔顿）8，有一些缺点是其在胚胎中的应用，在稍后阶段（比HH22阶段老年人-约3.5发展天）。例如，在稍后阶段卵黄膜是通常盟友坚持应当膜，并在外壳打开一个窗口，导致血管破裂，导致胚胎死亡;年纪较大的胚胎卵黄囊和尿囊血管，它是很难访问和操纵胚胎覆盖旧胚胎移动大力通过在shell中比较小的窗口，是难以控制的方向。 在这个协议中，我们证明前OVO电穿孔法基因转移到鸡胚胎后期（比HH22阶段旧）。对于前大毛电，是胚胎培养在培养皿9和卵黄和尿囊血管被广泛流传。在这些条件下，年龄较大的鸡胚胎很容易访问和操纵。因此，这种方法克服缺点，适用于年龄较大的鸡胚胎的OVO电。质粒使用这种方法，可以很容易地转成不同的部分老鸡胚胎10-12。

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Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

介绍将在以后的孵化阶段（比汉堡和汉密尔顿阶段（HH）22岁以上）的鸡胚胎的基因转移方法。这种方法克服缺点<em&gt;在OVO</em&gt;电适用于年龄较大的鸡胚胎是一种有用的技术，研究基因功能和调控，在旧的发展阶段。

基因转移到老年人的鸡胚<em&gt;前OVO</em&gt;电穿孔

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

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Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

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