的的质粒pCG001表达Ubp1好心提供的罗汉贝克在约翰·科廷学校的医学研究。这项工作是由of Dimes的研究资助，2011财年3月，3月Dimes的瓦西里·奥康纳入门学术研究奖＃5-FY20和美国国家科学基金会职业奖0746796。

1。应变工程工作流程<ol><li>插入序列编码（一）的膜定位序列，（b）一种快速成熟的荧光蛋白和（c）的蛋白酶识别序列的N-末端和在帧与感兴趣的蛋白质（ 例如，一个转录因子）。我们采用针对性的TSR-金星记者2膜，并融合到的蛋白酶识别序列的泛素（Ub）表达λ噬菌体阻遏CI蛋白质分子的数量进行计数。我们如何构建的融合蛋白TSR-金星-泛素CI，CI编码区取代了野生型和将构建到E.详细信息大肠杆菌染色体λRed重组3，详细描述在文献。 1。 </li><li>确认所有修改测序。 </li><li>变换特定于上面使用到的菌株表达的荧光报道和兴趣蛋白质的识别序列的质粒编码的蛋白酶在翻译融合。我们使用的的蛋白酶Ubp1，立即裂解后的C-末端泛素残基4。 </li></ol> 2。培养细胞和制备样品<ol><li>选择一个E.大肠杆菌菌落兴趣的新鲜条琼脂平板上为1毫升的M9媒体5辅以，与1X MEM氨基酸和适当的抗生素。在所需温度下在摇床上孵育足够长，达到OD 600&gt; 1.0（在600nm处的光密度）。 </li><li>稀释为1毫升新鲜的M9培养基中的文化与适当的抗生素OD 600 = 0.02。在适当的温度下，在振动机中孵育。如果需要的话，可以提高低温生长的初始细胞密度。 </li><li>当OD 600 = 0.2-0.3（在37℃下的初始细胞培养在OD 600 = 0.02，这将需要3-4小时），开始制备琼脂糖凝胶垫（步骤3）。 </li><li>该细胞是准备用于成像当OD <suB&gt; 600 = 0.3-0.4。 </li><li>转移至1.5 ml离心管中，离心分离机在台式的离心10000×g离心1分钟1毫升孵育文化。 </li><li>弃上清，加入1毫升新鲜的M9培养基中，并轻轻悬浮颗粒。 </li><li>以10,000 xg离心1分钟。 </li><li>重复步骤1.6和1.7。弃上清。 </li><li>轻轻重悬在1毫升M9培养基。细胞可直接用于显微镜成像或稀释的10 - 100倍，以确保低细胞密度为间隔拍摄成像。请注意，低细胞密度是重要的用于扩展“延时成像。的摄像室（步骤4）在实验过程中被密封。由于指数生长的细胞中，高的初始细胞浓度可以显著耗尽室内的氧气后长时间生长在凝胶垫，减少荧光蛋白的成熟，并影响细胞的生长。 </li></ol> 3。准备的琼脂糖解<ol><li>称取10〜20毫克低熔点温度琼脂糖成1.5毫升微量离心管中。 </li><li>添加适当的音量M9基本培养基，无抗生素，3％的琼脂糖溶液。 </li><li>琼脂糖溶液加热30分钟，在70℃以熔化，反相的管，以确保该溶液是完全熔化和均匀。凝胶垫可倾在这一点上（步骤4）中，或可以将温度降低至50℃，并保持几个小时以供以后使用。 </li></ol> 4。准备在会议厅凝胶垫<ol><li>约50分钟在成像之前，漂洗Microaqueduct的的幻灯片水。 </li><li>含漱1清洗玻璃盖（使用严格的清洗方法所描述的，如在6），并通过用压缩空气吹Microaqueduct用无菌水和干滑动。 </li><li>放置的橡胶垫圈，以便它涵盖上Microaqueduct幻灯片的滑动的Microaqueduct（玻璃侧的入口和出口上，这可以应用在修改通过媒体灌注样品）。应用50μl琼脂糖溶液（步骤3）的中心的Microaqueduct幻灯片。 </li><li>顶部的琼脂糖溶液清洁，干燥的玻璃盖。 </li><li>让琼脂糖溶液在室温下放置30分钟。 </li><li>同时，制备细胞样品（步骤2）。 </li><li>小心地剥离从凝胶垫的顶部的盖玻璃。加入1.0微升的洗涤过的细胞培养物的凝胶垫的顶部。等待〜2分钟，被吸收的凝胶垫的文化。重要的是不要等了这么久，的凝胶垫overdries，但足够长的细胞被正确地坚持以硅胶垫。理想的等待时间会随温度和湿度。 </li><li>在等待过程中，干其他预清洗玻璃盖。 </li><li>量的样品，用新的玻璃盖，确保的盖玻璃和Microaqueduct的滑动以及对齐。 </li><li>组装的温度控制的生长室中，按照生产商的说明。现在它可以被用于显微镜（步骤5）的成像。 </li></ol> 5。间隔拍摄电影的成像和收购<ol><li>打开后，制造商的说明（ 例如，激光可能需要加热的〜0.5小时，在实验前）上的激光和显微镜。 </li><li>锁定组装室，舞台上插入的显微镜。生长室的温度设置在37℃下或其他所需的生长温度和物镜加热器。 </li><li>如果在室温以上的成像，焦点或凝胶垫通常会漂移显著〜15分钟后，初始温度换档。在实践中，利用这段时间找到地区的利益和修改成像脚本，作为必要的实验。 </li><li>查找在显微镜上的细胞，并使其居中一个预定义的和对准的摄像区域内存储的位置后，每一个电池单体。多于一个小区可以被成像在每个图像中采集时间窗口。为间隔拍摄成像以上米任何世代，确保成像的细胞最初来自其他细胞分离由至少几百μm，以便其他菌落在生长过程中，将不进入摄像区域。 </li><li>调整激光激发强度，因此，几乎所有的荧光分子光漂白剂在6曝光（ 图5）。 </li><li>使用自动成像脚本/日记，获得延时“的数据，使用在图3中的工作流程中的实验中描述的算法。 </li></ol>

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我们有没有公开。

CoTrAC方法可以推广到测量生产的常规的N-或C-末端的荧光蛋白融合的其它蛋白质，可能会破坏蛋白质的活性。 CoTrAC战略有三个独特的优势，目前的方法。首先，合作翻译融合确保为每个感兴趣的蛋白质分子的，一个分子中的荧光报道产生，允许实时蛋白质生产的准确计数。其次，膜 - 定位记者TSR-金星使荧光记者的单分子检测，从而能够检测在非常低的水平表达的蛋白质。第三和最重要的是，中的...

<table border="1"><tbody><tr><td> 的试剂的名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论（可选） </td></tr><tr><td>琼脂糖（低熔融温度） </td><td>龙沙</td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q超纯水H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5×M9盐</td><td></td><td></td><td>以下配方9 </td></tr><tr><td> 20％葡萄糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 硫酸镁 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 氯化钙 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50×MEM氨基酸溶液</td><td> Invitrogen公司</td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td>温度控制生长房间 舞台适配器</td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td> Bioptechs </td><td>模型依赖于显微镜的物镜</td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct幻灯片</td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td>微盖玻片</td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td>可能是困难的源，也可从Bioptechs </td></tr><tr><td>封面玻璃/滑动垫片</td><td> Bioptechs </td><td> FCS20.75毫米</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>各个</td><td>设置示例：相干伊诺308C氩离子激光，奥林巴斯IX-81显微镜，奥林巴斯PlanApo 100X NA 1.45目标，Metamorph软件</td><td>必须有激光激发下，自动化XYZ阶段，脚本和自动对焦成像的自动化软件，能够，能够resolvin光学g单荧光蛋白</td></tr><tr><td> EM-CCD相机</td><td>各个</td><td>设置示例：安道尔IXON DU-898 </td><td>必须具有足够低噪声检测到上述背景下的单一荧光蛋白</td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

我们描述的荧光显微镜法，共翻译激活由裂解（CoTrAC）图像与单分子的精确度不扰动的蛋白质的功能的情况下，在活细胞中的蛋白质分子的生产。此方法使得能够顺序，五分钟的时间窗期间在一个小区中产生的蛋白质分子的数目进行计数。它需要一个与激光激发功率密度为约0.5至1千瓦/厘米2，这是足够敏感的检测单一的荧光蛋白在活细胞中的分子的荧光显微镜。在此方法中所使用的荧光报道，由三部分组成：膜击靶序列，一个快速成熟的，黄色荧光蛋白和蛋白酶识别序列。记者感兴趣的蛋白质的N-末端的翻译融合。细胞生长在一个温度控制的显微镜载物台上。每五分钟后，细胞内的荧光分子成像（以及后来的合作unted通过分析荧光图像），并随后photobleached让只有新翻译的蛋白质在接下来的测量计数。 ，此方法产生的荧光图像，可以通过检测在每个图像中，将它们分配到单个细胞的荧光斑点，然后分配的细胞谱系的细胞进行分析。的数目计算出一个时间窗口内的一个给定的细胞产生的蛋白质的是，集成的斑点的荧光强度除以由单个荧光分子的平均强度。我们用这种方法测量的0-45的分子在单5分钟时间窗的范围中的表达水平。这种方法使我们能够测量噪声的λ阻遏CI的表达，并在系统生物学中有许多其他潜在的应用。

从CoTrAC跟踪生产的λ阻遏CI实验的典型结果示于图4和图5。在这个实验中，12个菌落成像以5分钟的间隔。在每个时间点，菌落第一自动对焦和集中的摄像区域内。接下来，中心/中心的位置，存储和一个亮场图像被收购。然后阶段易位〜0.5微米，从明场焦平面沿z轴移动的平面等分的细胞（无相位对比或微分干涉相差（DIC）的光学，半透明的对象可以被成像在稍外的聚焦平面<...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

我们描述的荧光显微镜法，共翻译激活由裂解（CoTrAC），对图像的生产与单分子的精确度不扰动的蛋白质的功能的情况下，在活细胞中的蛋白质分子。此方法已被用于按照随机表达动力学的一种转录因子，λ阻遏CI<sup&gt; 1</sup&gt;。

单分子成像的基因调控<em在体内</em使用转位激活裂解（CoTrAC）

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

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