PCG001 פלסמיד להביע Ubp1 סופק באדיבות על ידי רוהאן בייקר בג&#39;ון קרטין בית הספר למחקר רפואי. עבודה זו מומנה על ידי מצעד הפרוט מענק המחקר 1-FY2011, מרץ הפרס פרוט זיל אוקונור Starter Scholar Research # 5 FY20 ואות קריירה של NSF 0746796.

1. זרימת עבודת הנדסת מתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קידוד רצפים () רצף קרום לוקליזציה, (ב) חלבון מהיר התבגרות פלורסנט ו( ג) רצף הכרת פרוטאז N-מסוף ולמסגרת עם חלבון של עניין (גורם שעתוק לדוגמה). אנחנו השתמשנו הקרום הממוקד כתב TSR-2 ונוס והתמזגנו זה ברצף פרוטאז הכרת יוביקוויטין (UB) לספור את מספר המולקולות הביעו bacteriophage λ מדכאי CI חלבון. פרטים על אופן בו אנו נבנינו חלבון היתוך TSR-ונוס-UB-CI, החלפה פרועה סוג קידוד CI אזור ושילוב המבנה לE. כרומוזום חיידק באמצעות רקומבינציה λ האדום 3, מתואר בפירוט בנ&quot;צ. 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את כל השינויים ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך קידוד פלסמיד פרוטאז ספציפי לרצף ההכרה בשימוש מעל לתוך זן מבטא את הכתב והחלבון פלואורסצנטי של ענייןבהיתוך translational. אנחנו השתמשנו פרוטאז Ubp1, שחותך מייד לאחר שאריות יוביקוויטין C-מסוף 4. </li></ol> 2. תאי תרבות ולהתכונן לדוגמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אחד E. מושבת coli ריבית מצלחת אגרה טרי מפוספסת למיליליטר M9 מדיה 1 מינימאלית 5 בתוספת חומצות אמינו 1X ממ ואנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בייקרה בטמפרטורה רצויה מספיק זמן כדי להגיע OD 600&gt; 1.0 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את התרבות למדיום M9 טרי 1 מ&quot;ל באנטיביוטיקה מתאימה לOD 600 = 0.02. דגירה בייקרה בטמפרטורה המתאימה. צפיפות תאית ראשונית ניתן להגדיל במידת צורך לצמיחה בטמפרטורה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר OD 600 = 0.2-0.3 (ב 37 ° C עם תרבית תאים ראשונית בOD 600 = 0.02, זה ייקח שעתי 3-4), להתחיל להכין את agarose ג&#39;ל הכרית (שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מוכנים להדמיה כאשר OD <sub&gt; 600 = 0.3-0.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התרבות דגרה 1 מ&quot;ל לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge, צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1 בmicrocentrifuge benchtop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולהוסיף בינוניים M9 מ&quot;ל טרי 1 וresuspend הגלולה בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב 1.6 ו 1.7. השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend עדינות במיליליטר M9 מדיה 1. תאים יכולים לשמש ישירות להדמית מיקרוסקופ או 10 מדוללים - ל100-קיפול על מנת להבטיח צפיפות נמוכה של תאים להדמית timelapse. שים לב שהצפיפות נמוכה של תאים חשובות להדמית timelapse מורחבת. חדר ההדמיה (שלב 4) הוא חתום במהלך הניסוי. בשל גידול המעריכי של תאים, תאי ריכוזים ראשוניים גבוהים באופן משמעותי יכולים לרוקן חמצן בתוך התא לאחר צמיחה ממושכת בכרית ג&#39;ל, הפחתת הבשלת החלבון פלואורסצנטי ומשפיע על גדילת תאים. </li></ol> 3. הכן את פתרון agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 10-20 מ&quot;גהיתוך בטמפרטורה הנמוכה agarose לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום המתאים M9 נפח מינימאלי ללא אנטיביוטיקה לעשות 3% פתרון agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את פתרון agarose למשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי להמס, היפוך הצינור כדי להבטיח שהפתרון הוא לגמרי נמס והומוגנית. כרית ג&#39;ל אפשר לשפוך בשלב זה (שלב 4) או הטמפרטורה יכולה להיות ירידה ל 50 מעלות צלזיוס והחזיקה למשך מספר שעות לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 4. הכן Pad ג&#39;ל בלשכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אודות 50 דקות לפני ההדמיה, לשטוף שקופית Microaqueduct עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1 ניקה מכסה זכוכית (באמצעות שיטת ניקוי מחמירה כמו זו המתוארת ב6) וMicroaqueduct שקופית עם מים סטריליים ויבשים על ידי נשיפה עם אוויר דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את אטם הגומי בשקופית Microaqueduct כך שהוא מכסה את פתחי כניסה ושקעים בצד כוס שקופית Microaqueduct (זה יכול להיות שונה עבור יישומיםשתקשורת היא perfused באמצעות המדגם). החל פתרון 50 μl agarose (שלב 3) למרכז שקופית Microaqueduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה פתרון agarose עם ניקה זכוכית, היבשה הכיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו פתרון agarose לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכין מדגם תא (שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לקלף את מכסה הזכוכית מהחלק העליון של כרית ג&#39;ל. הוסף תרבית תאים שטופה μl 1.0 לחלק העליון של כרית ג&#39;ל. חכה ~ 2 דקות לתרבות להיספג על ידי כרית ג&#39;ל. חשוב לא לחכות זמן רב כל כך שoverdries הכרית ג&#39;ל, אבל ארוך מספיק כדי שתאים מודבקים היטב למשטח ג&#39;ל. זמן ההמתנה האידיאלי ישתנה בהתאם לטמפרטורה ולחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן המתנה, לייבש מכסה זכוכית precleaned אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את המדגם עם מכסה הזכוכית החדשה להבטיח כי מכסה הזכוכית ושקופית Microaqueduct מיושרות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את חדר צמיחה בטמפרטורה המבוקרת בהתאם להוראות היצרן.עכשיו זה יכול לשמש להדמיה במיקרוסקופ (שלב 5). </li></ol> 5. הדמיה ורכישת סרטי timelapse <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הליזר ומיקרוסקופ בעקבות הוראות היצרן (למשל הליזר ייתכן שיצטרך התחמם במשך ~ 0.5 שעות לפני הניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את החדר כנס להוספת השלב במיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה של חדר הצמיחה והתנור בטמפרטורה האובייקטיבי צמיחה רצויה אחרת 37 ° C או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה מעל טמפרטורת חדר, המיקוד או כרית ג&#39;ל בדרך כלל נסחף באופן משמעותי ל~ 15 דקות אחרי שינוי הטמפרטורה ההתחלתית. בפועל, להשתמש בזמן הזה כדי למצוא אזורים של עניין ולשנות תסריטי הדמיה לפי צורך לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את התאים במיקרוסקופ ולאחסן את המיקום של כל תא לאחר שמרכזו בתוך אזור מוגדר מראש הדמיה ומיושרת. יותר מתא אחד יכול להיות צלם בכל חלון זמן רכישת תמונה. לtimelapse הדמיה מעל מ &#39;דורות כלשהם, ודאו כי תאי הדמיה מופרדים בתחילה מתאים אחרים בלפחות כמה מאה מיקרומטר כך שמושבות אחרות לא להיכנס לאזור ההדמיה במהלך צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם עוצמת עירור ליזר, כך שכמעט כל photobleach ניאון המולקולות בתוך 6 חשיפות (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הסקריפט אוטומטי הדמיה / יומן, איסוף נתוני timelapse שימוש באלגוריתם שתואר בעבודה הניסיונית באיור 3. </li></ol>

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

אין לנו שום גילויים.

שיטת CoTrAC ניתן להכליל למדוד את הייצור של חלבונים אחרים כאשר N-או קונבנציונלי fusions החלבון פלואורסצנטי C-מסוף עלול לשבש את פעילות חלבון. אסטרטגית CoTrAC יש שלושה יתרונות ייחודיים על פני שיטות קיימות. ראשית, ההיתוך משותף translational מבטיח שמולקולה אחת של כתב הניאון מיוצרת עבור כל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Agarose (טמפרטורת התכה נמוכה) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> מילי-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × מלחי M9 </td><td></td><td></td><td> המתכון הבא מתואר ב9 </td></tr><tr><td> 20% גלוקוז </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × פתרון חומצת אמין MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> צמיחת טמפרטורה מבוקרתלשכה מתאם שלב </td><td> BIOPTECHS </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> מחמם אובייקטיבי </td><td> BIOPTECHS </td><td> מודל תלוי במטרת מיקרוסקופ </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct שקופיות </td><td> BIOPTECHS </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> משקפים לכסות Micro </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> יכול להיות קשה למקור; זמין גם BIOPTECHS </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית / אטם שקופית </td><td> BIOPTECHS </td><td> 0.75 מ&quot;מ FCS2 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> שונה </td><td> הגדרת דוגמה: קוהירנט Innova 308C ארגון יון הליזר, אולימפוס מיקרוסקופ IX-81, 1.45 אובייקטיבי אולימפוס PlanApo 100X NA, Metamorph תוכנה </td><td> חייב להיות עירור ליזר, שלב xyz אוטומטי, תוכנת אוטומציה מסוגלת הדמיה ופוקוס אוטומטי תסריט, אופטיקה מסוגלים Resolvinחלבוני ניאון בודדים גרם </td></tr><tr><td> מצלמת EM-CCD </td><td> שונה </td><td> הגדרת דוגמה: תידור iXon DU-898 </td><td> חייב להיות רעש נמוך מספיק כדי לזהות חלבוני ניאון בודדים מעל הרקע </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC) לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו מאפשרת לספור את המספרים של מולקולות חלבון היוצר בתא אחד בחלונות זמן רציפים של חמש דקות. זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם צפיפות הספק עירור ליזר של ~ 0.5-1 קילוואט / 2 סנטימטר, שהוא רגיש מספיק כדי לזהות מולקולות חלבון ניאון בודדות בתאים חיים. כתב הניאון בשימוש בשיטה זו מורכב משלושה חלקים: רצף קרום מיקוד, מהר התבגרות חלבון, צהוב ניאון ורצף הכרת פרוטאז. הכתב הוא התמזג translationally לN-הסופי של חלבון של עניין. תאים גדלים על במת מיקרוסקופ טמפרטורה מבוקרת. כל חמש דקות, מולקולות ניאון בתוך תאים הם צלמו (ומאוחר יותר שיתוףunted על ידי ניתוח תמונות פלואורסצנציה) ולאחר מכן photobleached כך שחלבונים שתורגמו רק לאחרונה נספרים במדידה הבאה. תמונות פלואורסצנציה נובעות משיטה זו ניתן לנתח על ידי איתור נקודתי ניאון בכל תמונה, הקצאתם לתאים בודדים ולאחר מכן הקצאת תאים לשושלות תאים. מספר חלבונים המיוצרים בתוך חלון זמן בתא נתון מחושב על ידי חלוקת עוצמת הקרינה המשולבת של כתמים מהעוצמת הממוצעת של מולקולות ניאון בודדות. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד את רמות ביטוי בטווח של 0-45 מולקולות ב 5 חלונות זמן דקות בודדות. שיטה זו אפשרה לנו למדוד את הרעש בביטוי של λ repressor CI, ויש יישומים פוטנציאליים רבים אחרים בביולוגית מערכות.

תוצאות אופייניות מניסוי CoTrAC מעקב הייצור של λ repressor CI מוצגות באיורי 4, 5. בניסוי זה, 12 מושבות צלמו במרווחי 5 דקות. בכל נקודת זמן, מושבת autofocused הראשון ורכזה בתוך אזור ההדמיה. בשלב הבא, העמדה במרכז / ממוקד הייתה מאוחסנת ותמונת brightfield נרכשה. אז הבמה הייתה translocated ידי ~ 0.5...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

9.8K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor CI 1.

Video: Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes can be demonstrated by combining current measurements with a biotinylation approach to investigate the appearance of ion channel cleavage products at the cell surface. Functionally important cleavage sites can be identified by using site-directed mutagenesis.

הפגנה של מפרקי חלבוני הפעלה של אפיתל נתרן הערוץ (ENaC) על ידי שילוב של מדידות זרם עם איתור של שברי מחשוף

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...