Das Plasmid pCG001 Ausdruck UBP1 wurde freundlicherweise von Rohan Baker an der John Curtin School of Medical Research. Diese Arbeit wurde von March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 und NSF CAREER Award 0.746.796 finanziert.

Ein. Belastung Engineering Workflow <ol><li> Legen Sequenzen kodiert (a) eine Membran-Lokalisierungssequenz, (b) eine schnell reifenden fluoreszierendes Protein und (c) eine Protease-Erkennungssequenz N-terminal zu und im Leserahmen mit einem Protein von Interesse (zB ein Transkriptionsfaktor). Wir verwendeten die Membran gezielt Tsr-Venus Reporter 2 und fusioniert an die Protease Erkennungssequenz Ubiquitin (Ub), die Anzahl der Bakteriophage λ ausgedrückt Repressor CI Proteinmoleküle zählen. Einzelheiten über konstruierten wir das Fusionsprotein Tsr-Venus-Ub-CI, Ersetzen des Wildtyp-CI Kodierregion und Einbringen des Konstrukts in die E. coli-Chromosom mit λ Red Rekombination 3, sind im Detail in ref beschrieben. Ein. </li><li> Überprüfen Sie alle Änderungen durch Sequenzierung. </li><li> Transformieren eines Plasmids, das eine Protease spezifisch für die Erkennungssequenz oben in einen Stamm, der die fluoreszierende Reporter und Protein von Interesse verwendetin translationale Fusion. Wir verwendeten die Protease UBP1, die sofort spaltet nach der C-terminale Rest 4 Ubiquitin. </li></ol> 2. Kultur Cells und Probe vorbereiten <ol><li> Wählen Sie ein E. coli-Kolonie von Interesse aus einer frisch ausgestrichenen Agarplatte in 1 ml M9 Minimalmedium 5 mit 1X MEM Aminosäuren und geeigneten Antibiotika ergänzt. Inkubieren in einem Schüttler bei gewünschte Temperatur lange genug, um zu erreichen OD 600&gt; 1,0 (optische Dichte bei 600 nm). </li><li> Verdünnen Sie die Kultur in 1 ml frischem M9-Medium mit geeigneten Antibiotika zur OD 600 = 0,02. Inkubieren in einem Schüttler bei geeigneter Temperatur. Initial Zelldichte erhöht werden, wenn für die Tieftemperatur-Wachstum benötigt werden. </li><li> Wenn die OD 600 = 0,2-0,3 (bei ​​37 ° C mit einem anfänglichen Zellkultur bei OD 600 = 0,02, dies wird 3-4 Stunden dauern kann), beginnen die Vorbereitung der Agarosegel-Pad (Schritt 3). </li><li> Die Zellen sind zur Bildgebung bereit, wenn OD <sub&gt; 600 = 0,3-0,4. </li><li> Übertragen 1 ml inkubierten Kultur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Zentrifuge bei 10.000 xg für 1 min in einem Tischgerät Mikrozentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen und 1 ml frisches Medium M9 und das Pellet vorsichtig. </li><li> Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 Minute. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1,6 und 1,7. Überstand verwerfen. </li><li> Vorsichtig in 1 ml M9-Medien resuspendieren. Bis 100-fache zu geringen Zelldichten für timelapse Bildgebung sicherzustellen - Zellen können direkt für Mikroskopabbildanordnung oder verdünntem 10 verwendet werden. Beachten Sie, dass geringen Zelldichten wichtig sind für längere timelapse Bildgebung. Die Abbildungskammer (Schritt 4) während des Experiments abgedichtet. Durch exponentielle Wachstum der Zellen, können hohe anfängliche Zellkonzentration signifikant zum Abbau Sauerstoff in die Kammer nach längerer Wachstum in der Gel-Pad, wodurch fluoreszierende Protein Reifung und beeinflussen Zellwachstum. </li></ol> 3. Bereiten Sie die Agarose-Lösung <ol><li> Wiegen 10-20 mglow-Schmelztemperatur Agarose in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie entsprechende Volumen M9 Minimalmedium ohne Antibiotika, um eine 3% igen Lösung herzustellen. </li><li> Erwärmen der Agarose-Lösung für 30 min bei 70 ° C zu schmelzen, Invertieren des Rohres zu gewährleisten, dass die Lösung vollständig geschmolzen und homogen ist. Das Gelkissen kann an diesem Punkt (Schritt 4) gegossen werden, oder die Temperatur kann auf 50 ° C gesenkt werden und dort für mehrere Stunden zur späteren Verwendung. </li></ol> 4. Bereiten Gel Pad auf der Kammer <ol><li> Etwa 50 min vor der Bildgebung, spülen ein Microaqueduct Rutsche mit Wasser. </li><li> Lidspalt ein Deckglas reinigen (mit einem strengen Reinigungsverfahren wie das in 6 beschrieben) und Microaqueduct Schlitten mit sterilem Wasser und trocken durch Abblasen mit Druckluft. </li><li> Platzieren Sie die Gummidichtung auf den Schieber Microaqueduct so dass er die Ein-und Auslässe auf der Glasseite der Microaqueduct Schieber (deckt diese für Anwendungen im modifiziert werdenwelche Medien durch die Probe perfundiert). Anwenden 50 ul Agaroselösung (Schritt 3) in der Mitte des Schiebers Microaqueduct. </li><li> Ganz oben auf der Agarose-Lösung mit dem gereinigten, trockenen Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Agarose-Lösung bei Raumtemperatur stehen für 30 min. </li><li> Unterdessen bereiten eine Zellprobe (Schritt 2). </li><li> Ziehen Sie vorsichtig die Glasabdeckung von der Spitze des Gel-Polster. Fügen Sie 1,0 ul gewaschene Zellkultur an die Spitze des Gel-Polster. Warten für ~ 2 Minuten für die Kultur von der Gel-Polster absorbiert werden. Es ist wichtig, nicht so lange zu warten, dass die Gel-Polster overdries, aber lang genug, dass die Zellen richtig auf das Gel Pad eingehalten werden. Das Ideal Wartezeit wird mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit variieren. </li><li> Während des Wartens, trocknen anderen vorgereinigte Deckglas. </li><li> Decken Sie die Probe mit dem neuen Deckglas sicherzustellen, dass das Deckglas und Microaqueduct Objektträgers ausgerichtet sind. </li><li> Montieren Sie den temperierten Klimakammer nach den Anweisungen des Herstellers.Es kann nun zur Abbildung auf Mikroskop (Schritt 5) verwendet werden. </li></ol> 5. Imaging und Erwerb von Timelapse Filme <ol><li> Einschalten des Lasers und Mikroskop nach Herstellerangaben (zB der Laser muss möglicherweise aufgewärmt für ~ 0,5 Stunden vor dem Experiment). </li><li> Verriegeln Sie den zusammengesetzten Kammer auf die Bühne Einsatz am Mikroskop. Stellen Sie die Temperatur der Wachstumskammer und des Ziels Heizeinrichtung bei 37 ° C oder eine andere gewünschte Wachstumstemperatur. </li><li> Wenn Bildgebung oberhalb der Raumtemperatur, wird der Fokus oder die Gel-Polster in der Regel deutlich driften für ~ 15 min nach der anfänglichen Temperatur-Verschiebung. In der Praxis diese Zeit nutzen, um Bereiche von Interesse zu finden und zu ändern Bildgebung Script als notwendig für ein Experiment. </li><li> Finden Zellen auf dem Mikroskop und Speichern der Position einer jeden Zelle nach Zentrierung er innerhalb eines vordefinierten und ausgerichtet Bildgebungsregion. Mehr als eine Zelle in jeder Bildaufnahmezeit Fenster abgebildet werden. Für timelapse Abbildung über mirgendwelche Generationen, damit abgebildeten Zellen zunächst von anderen Zellen durch mindestens ein paar hundert um getrennt, so dass andere Kolonien nicht betreten wird die Bildgebungsregion während des Wachstums. </li><li> Passen Laseranregung Intensität, so dass fast alle fluoreszierende Moleküle Photobleichmittels innerhalb von 6 Aufnahmen (Abbildung 5). </li><li> Mit Hilfe eines automatisierten Imaging-Skript / journal erwerben timelapse Daten mit Hilfe des Algorithmus in der experimentellen Workflow in Abbildung 3 beschrieben. </li></ol>

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	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Wir haben keine Angaben.

Die CoTrAC Verfahren kann verallgemeinert werden, um die Produktion von anderen Proteinen, wo herkömmliche N-oder C-terminale Fusionen fluoreszierendes Protein-Protein-Aktivität zerstören kann messen. Die CoTrAC Strategie hat drei einzigartige Vorteile gegenüber den derzeitigen Methoden. Erstens sorgt co-translationale Fusion, daß ein Molekül des fluoreszierenden Reporter für jedes Molekül des Proteins von Interesse hergestellt wird, was eine genaue Zählung der Proteinproduktion in Echtzeit. Zweitens die Membra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Agarose (Low Schmelztemperatur) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q-H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × M9-Salze </td><td></td><td></td><td> Folgende Rezept in 9 beschrieben </td></tr><tr><td> 20% Glucose </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM Aminosäurelösung </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur-Controlled GrowthKammer Tischadapter </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Ziel Heater </td><td> Bioptechs </td><td> Modell hängt Mikroskopobjektiv </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kann schwierig sein Quelle; ebenfalls erhältlich von Bioptechs </td></tr><tr><td> Deckglas / slide Dichtung </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Verschiedene </td><td> Beispiel setup: Coherent Innova 308C Argon-Ionen-Laser, Olympus IX-81 Mikroskop Olympus PlanApo 100X NA 1,45 Ziel, Metamorph-Software </td><td> Muss Laseranregung, automatisierte xyz Bühne, Automatisierungs-Software in der Lage ist scripted Bildgebung und Autofokus, Optik in der Lage Resolvin habeng einzelner fluoreszierender Proteine </td></tr><tr><td> EM-CCD-Kamera </td><td> Verschiedene </td><td> Beispiel setup: Andor Ixon DU-898 </td><td> Muss niedrig genug Lärm haben, einzelne fluoreszierende Proteine ​​über den Hintergrund erkennen </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC) zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren macht es möglich, die Zahl der Proteinmoleküle in einer Zelle während sequentiell, fünfminütigen Zeitfenster produziert zählen. Es erfordert ein Fluoreszenzmikroskop mit Laseranregung Leistungsdichte von ~ 0,5 bis 1 kW / cm 2, die empfindlich genug, um einzelne Moleküle fluoreszierende Protein in lebenden Zellen nachzuweisen ist. Das fluoreszierende Reporter in diesem Verfahren verwendet wird, besteht aus drei Teilen: eine Membran-Targeting-Sequenz, eine Fast-Reifung, gelb fluoreszierendes Protein und ein Protease-Erkennungssequenz. Der Reporter translatorisch an den N-Terminus eines Proteins von Interesse fusioniert ist. Zellen werden auf einer Temperatur-gesteuerten Mikroskoptisch gewachsen. Alle fünf Minuten werden fluoreszierende Moleküle in Zellen abgebildet (und später coUNTED durch die Analyse von Fluoreszenz-Bildern) und anschließend Lichtgeschädigte so dass nur neu übersetzt Proteine ​​in der nächsten Messung gezählt. Fluoreszenzbilder aus diesem Verfahren kann durch Erfassen Fluoreszenzpunkte in jedem Bild, ihre Zuordnung zu einzelnen Zellen und dann Zuweisen Zellen Zelllinien analysiert werden. Die Anzahl von Proteinen innerhalb eines Zeitfensters in einer gegebenen Zelle erzeugt wird durch Dividieren der integrierten Intensität der Fluoreszenz von Flecken durch die durchschnittliche Intensität der einzelnen fluoreszierenden Moleküle berechnet. Wir verwendeten diese Methode zum Expressionslevel in dem Bereich von 0-45 Molekülen in einzelnen Zeitfenstern 5 min zu messen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, Rauschen in dem die Expression des λ-Repressor CI messen, und hat viele andere potentielle Anwendungen in Systembiologie.

Typische Ergebnisse aus einem Versuch CoTrAC Verfolgen der Herstellung des λ-Repressor CI sind in den 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 12 Kolonien in 5 min Intervallen abgebildet. Zu jedem Zeitpunkt wurde die erste Kolonie autofocused und zentralisiert innerhalb der Bildgebungsregion. Als nächstes wurde die mittig / fokussierte Position gespeichert und ein Hellfeld Bild erworben wurde. Die Stufe wurde dann von ~ 0,5 um entlang der z-Achse von der translozi...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC), zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Expression stochastische Dynamik eines Transkriptionsfaktors, dem λ-Repressor CI folgen<sup&gt; 1</sup&gt;.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

9.8K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC), zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Expression stochastische Dynamik eines Transkriptionsfaktors, dem λ-Repressor CI folgen 1.