Ubp1 ifade plazmid pCG001 nazik Tıbbi Araştırma John Curtin Okulu&#39;nda Rohan Baker tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma Dimes Araştırma Bursu 1-FY2011 Mart Dimes, Basil O&#39;Connor Başlangıç ​​Akademik Araştırma Ödülü # 5-FY20 ve NSF KARİYER Ödülü 0.746.796 Mart tarafından finanse edildi.

1. Gerinim Mühendislik İş Akışı <ol><li> Dizileri kodlama (a) bir zar-yerelleştirme dizisi, (b) bir hızla olgunlaşan floresan protein ve bir ilgi ve protein (örneğin, bir transkripsiyon faktörü) ile çerçeve (c) bir proteaz tanıma sekansı, N-terminalinde. Ekleme Biz Tsr-Venüs muhabiri 2 hedef membran kullanılan ve ifade bakteriyofaj λ repressör CI protein moleküllerinin sayısını saymak için Ubikitin proteaz tanıma dizisi (Ub) için erimiş. Biz bölgenin kodlama CI yabani tip değiştirilmesi ve E. içine yapı birleştiren, füzyon proteini Tsr-Venus-UB-CI inşa nasıl Detayları λ Red 3 rekombinasyon kullanılarak coli kromozomu, ref ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. 1. </li><li> Sıralanmasıyla tüm değişiklikler doğrulayın. </li><li> Bir plazmid kodlama ilgi flüoresan raportör proteini eksprese eden ve bir yük içine yukarıda kullanılan tanıma dizisi için spesifik bir proteaz Dönüşümütranslasyonel füzyon. Bu C-terminal artığı ubikitin 4 hemen sonra parçalayarak proteaz Ubp1 kullanılmıştır. </li></ol> 2. Kültür Hücreler ve örnek hazırlayın <ol><li> Biri E. seçin taze streaked agar plağından ilgi coli kolonisi 1 ml M9 minimal medya içine 5 1X MEM amino asitler ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş. İstenen sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde inkübe yeterince uzun ulaşmak için OD 600&gt; 1.0 (600 nm de optik yoğunluk). </li><li> OD 600 = 0.02 için uygun antibiyotik ile 1 ml taze M9 ortama kültürü seyreltin. Uygun bir sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde inkübe edin. Düşük sıcaklık büyümesi için gerekli olmadığını Ilk hücre yoğunluğunda artış olabilir. </li><li> OD 600 = 0.2-0.3 (37 OD 600 bir başlangıç ​​hücre kültürü ile ° C = 0.02, bu 3-4 saat sürer), agaroz jel pedi (adım 3) hazırlarken başladığınızda. </li><li> Zaman OD hücreleri görüntüleme için hazır <sub&gt; 600 = 0.3-0.4. </li><li> 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir benchtop mikrosantrifüj 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj içine 1 ml İnkübe kültürü aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve 1 ml taze M9 orta ekleyin ve pelet hafifçe tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1.6 ve 1.7 adımları tekrarlayın. Süpernatantı atın. </li><li> Yavaşça 1 ml M9 medyada tekrar süspansiyon haline getirin. Timelapse görüntüleme için düşük hücre yoğunlukları sağlamak üzere 100-kat için - hücreler direkt olarak mikroskop görüntüleme ya da seyreltilmiş 10 için de kullanılabilir. Düşük hücre yoğunlukları uzatılmış timelapse görüntüleme için önemli olduğunu unutmayın. Görüntüleme odası (adım 4) deneme sırasında mühürlenir. Hücrelerin üstel büyüme nedeniyle, yüksek başlangıç ​​hücre konsantrasyonları anlamlı floresan protein olgunlaşması azaltılması ve hücre büyümesini etkileyen, jel pedi uzun süreli büyüme sonra odasının içindeki oksijeni tüketebilir. </li></ol> 3. Agaroz Çözüm hazırlayın <ol><li> 10-20 mg tartılır1,5 ml mikrosantrifüj tüpe düşük erime sıcaklığına agaroz. </li><li> % 3 agaroz çözüm yapmak antibiyotik vermeden uygun miktarda M9 minimal orta ekleyin. </li><li> 70, 30 dakika için agaroz çözelti ısıtılır ° C, çözelti tamamen eritilmiş ve homojen olmasını sağlamak için ters tüp eritir. Jel pedi bu noktada (adım 4) dökülecek veya sıcaklık 50 ° C&#39;ye düşmüş ve daha sonra kullanmak için birkaç saat tutulabilir. </li></ol> 4. Odası Jel Tampon hazırlayın <ol><li> Görüntüleme öncesinde yaklaşık 50 dakika su ile bir Microaqueduct slayt durulayın. </li><li> Bir kapak cam temizliği (6 açıklandığı gibi zaten sıkı bir temizleme yöntemi ile) ve basınçlı hava ile üfleme steril su ve kuru ile slayt Microaqueduct tutunuz. </li><li> Bu uygulamalar için modifiye edilebilir Microaqueduct sürgüyle (arasında cam tarafında giriş ve çıkışları kapsayan, böylece Microaqueduct slayt üzerinde lastik bir contahangi medya) numune içinden perfüze edilmiştir. Microaqueduct slaydın merkezine 50 ul agaroz çözeltisi (adım 3) uygulanır. </li><li> Temiz, kuru cam kapak ile agaroz çözüm ekleyin. </li><li> Agaroz çözelti 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. </li><li> Bu arada, (adım 2), bir hücre örneği hazırlamak. </li><li> Dikkatle jel ped üst cam kapak soyulabilir. Jel yastığı başına 1.0 ul yıkanmış hücre kültürü ekleyin. Jel pedi tarafından absorbe edilecek kültür için ~ 2 dakika bekleyin. O kadar uzun beklemek değil önemli olduğunu jel pedi overdries, ama yeterince uzun hücrelerinin düzgün jel pedi uyduğunu. İdeal bekleme süresi sıcaklık ve nem ile değişir. </li><li> Beklerken, başka precleaned cam kapak kurulayın. </li><li> Cam kapak ve Microaqueduct slayt iyi hizalanmış olduğunu kontrol ettikten yeni cam kapak ile örnek örtün. </li><li> Üreticinin yönergelerini izleyerek sıcaklık kontrollü iklim odasında birleştirin.Şimdi mikroskobu (adım 5) görüntüleme için kullanılabilir. </li></ol> 5. Görüntüleme ve Timelapse Filmler kazanılması <ol><li> Üreticinin talimatlarına (örneğin lazer deney öncesi ~ 0.5 saat süreyle ısınmış gerekebilir) takiben lazer ve mikroskop açın. </li><li> Mikroskop sahne yazısına monte odasına kilitleyin. Büyüme oda sıcaklığı ve 37 ° C ya da istenen diğer büyüme sıcaklıkta amaç ısıtıcı ayarlayın. </li><li> Oda sıcaklığının üzerinde görüntüleme, odak ya da jel pedi genellikle ilk sıcaklık kayması sonra ~ 15 dakika için önemli ölçüde sürüklenir. Uygulamada, ilgi alanları bulmak ve bir deney için gerekli görüntüleme komut dosyalarını değiştirmek için bu kez kullanın. </li><li> Mikroskop hücreleri bulun ve önceden tanımlanmış ve hizalanmış görüntüleme bölgede bu merkezleme sonra her hücrenin konumunu kaydetmek. Birden fazla hücre Her görüntü alımından zaman penceresinde görüntülenebilir. M üzerinde timelapse görüntüleme içinherhangi kuşaklar, diğer koloniler büyüme sırasında görüntüleme bölge girmeyecek şekilde görüntülü hücreleri başlangıçta yüz, en az birkaç mikron ile diğer hücrelerinden ayrılan olduğundan emin olun. </li><li> Böylece lazer uyarma yoğunluğunu ayarlayın ki 6 poz içindeki hemen hemen tüm floresan molekülü photobleach (Şekil 5). </li><li> , Otomatik bir görüntü dosyası / günlük, Şekil 3 &#39;de açıklanan deneysel akışı algoritması kullanılarak veri timelapse elde kullanılması. </li></ol>

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Biz hiçbir açıklama yok.

CoTrAC yöntemi geleneksel N-veya C-terminali floresan proteini füzyon proteini etkinliği bozabilir diğer proteinlerin üretimini ölçmek için yaygın olabilir. CoTrAC stratejisi mevcut yöntemler üzerinde üç benzersiz avantajlara sahiptir. İlk olarak, eş-translasyonel füzyon flüoresan raportör molekülü, gerçek zamanlı olarak protein üretim doğru sayımı izin veren, ilgilenilen proteinin her bir molekül için üretilmiş olmasını sağlar. İkincisi, membran hedefli muhabiri Tsr-Venüs çok düşü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Agaroz (Düşük erime sıcaklığı) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H2O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 x M9 tuzlan </td><td></td><td></td><td> Aşağıda tarif 9&#39;da tarif edildiği gibi </td></tr><tr><td> % 20 glikoz </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x MEM amino asit solüsyonu </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrollü BüyümeBölme Sahne adaptörü </td><td> Bioptechs </td><td> -2 FCS </td><td></td></tr><tr><td> Amaç Isıtıcı </td><td> Bioptechs </td><td> Model mikroskop objektif bağlıdır </td><td></td></tr><tr><td> Slayt Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro kapağı gözlük </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kaynağı zor olabilir; Bioptechs adresinden de bulunabilir </td></tr><tr><td> Cam / slayt conta Kapak </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> Çeşitli </td><td> Örnek kurulum: Tutarlı Innova 308C Argon iyon lazer, Olympus IX-81 mikroskop, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 hedefi, Metamorph yazılım </td><td> Lazer uyarma, otomatik xyz aşamasında, komut dosyası görüntüleme ve otofokus yeteneğine otomasyon yazılımı, resolvin yeteneğine optik olmalıg tek floresan proteinleri </td></tr><tr><td> EM-CCD Kamera </td><td> Çeşitli </td><td> Örnek kurulum: Andor Ixon DU-898 </td><td> Arka plan üstüne tek floresan proteinleri tespit etmek için yeterince düşük gürültü olmalı </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC) proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bu mümkün ardışık beş dakikalık bir zaman pencereleri sırasında bir hücre tarafından üretilen protein moleküllerinin sayısını saymak mümkün kılar. Bu canlı hücrelerde tek floresan protein molekülleri tespit etmek için yeterince hassas olan ~ 0,5 1 kW / cm 2, lazer uyarma güç yoğunluğuna sahip bir floresan mikroskop gerektirir. Bir zar hedefleme sırası, bir hızlı-olgunlaşma, sarı floresan protein ve bir proteaz tanıma sekansı: bu yöntemde kullanılan flüoresan raportör üç parçadan oluşur. Raportör Çevrimsel ilgi çeken bir proteinin N-terminusunda için eritilerek birleştirilir. Hücreler bir sıcaklık kontrollü mikroskop sahnede yetiştirilir. Her beş dakikada, hücrelerin içindeki floresan molekülü (ve daha sonra eş görüntülü) floresans görüntüleri analiz ederek unted ve sadece yeni tercüme proteinler sonraki ölçüm sayılan böylece sonradan photobleached. Bu yöntem sonucunda floresans görüntüler, her bir görüntü floresan noktalar tespit tek hücreleri atayarak ve ardından hücre soylarının hücreleri atayarak analiz edilebilir. Belirli bir hücreye bir zaman penceresi içinde üretilen proteinlerin sayısı tek flüoresan moleküllerinin ortalama yoğunluk tarafından lekelerin entegre floresan yoğunluğu bölünmesiyle hesaplanır. Bu tek bir 5 dakikalık bir zaman pencereleri içinde 0-45 molekül aralığında ifade seviyelerini ölçmek için bu yöntem kullanılır. Bu yöntem bize λ repressör CI ifadesi gürültü ölçmek için etkin ve sistem biyolojisi diğer birçok potansiyel uygulamalar vardır.

Λ repressör CI üretim takip bir CoTrAC deneyden elde Tipik sonuçlar Şekiller 4 ve 5 &#39;de gösterilmiştir. Bu deneyde, 12 koloniler 5 dakika aralıklarla görüntülenmiştir. Her zaman noktasında, koloni birinci autofocused edildi ve görüntüleme bölge içinde merkezi. Sonraki odaklı / merkezli pozisyonu saklanan ve aydınlık görüntü elde edildi. Evresi hücrelerin (faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik olmadan bisecting düzlemine aydınlık oda...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC), proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bir transkripsiyon faktörü, λ repressör CI stokastik ifade dinamik takip etmek için kullanılmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

9.8K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC), proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bir transkripsiyon faktörü, λ repressör CI stokastik ifade dinamik takip etmek için kullanılmıştır 1.