Il pCG001 plasmide che esprime Ubp1 è stato gentilmente fornito da Rohan Baker presso la John Curtin School of Medical Research. Questo lavoro è stato finanziato dal March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Research Scholar Award Starter N ° 5-FY20 e di aggiudicazione CARRIERA NSF 0746796.

1. Flusso di lavoro Strain Ingegneria <ol><li> Inserire codifica sequenze (a) una membrana-localizzazione sequenza, (b) una rapida maturazione proteina fluorescente e (c) una sequenza di riconoscimento proteasi N-terminale e in frame con una proteina di interesse (ad esempio, un fattore di trascrizione). Abbiamo usato la membrana mirata Tsr-Venus 2 giornalista e fuso alla sequenza di riconoscimento proteasi ubiquitina (Ub) per contare il numero di espresse batteriofago λ repressore molecole proteiche CI. I dettagli su come abbiamo costruito la proteina di fusione Tsr-Venere-Ub-CI, che sostituisce il wild-type CI regione codificante e incorporando il costrutto in E. cromosoma coli usando λ ricombinazione Red 3, sono descritte in dettaglio in rif. 1. </li><li> Verificare che tutte le modifiche mediante sequenziamento. </li><li> Trasformare un plasmide codificante una proteasi specifica per la sequenza di riconoscimento utilizzato sopra in un ceppo che esprime il reporter fluorescente e la proteina di interessein fusione traslazionale. Abbiamo usato la proteasi Ubp1, che scinde subito dopo il residuo C-terminale Ubiquitina 4. </li></ol> 2. Cellule Cultura e preparare campioni <ol><li> Scegli uno E. colonia coli di interesse da una piastra di agar appena striato in 1 ml di M9 minima media 5 integrato con 1X acidi MEM amminoacidi e antibiotici appropriati. Incubare in un agitatore a temperatura voluta abbastanza a lungo per raggiungere OD 600&gt; 1,0 (densità ottica a 600 nm). </li><li> Diluire la cultura in 1 ml di terreno fresco M9 con antibiotici appropriati per OD 600 = 0,02. Incubare in un agitatore a temperatura adeguata. Densità cellulare iniziale può essere aumentato se necessario per la bassa temperatura di crescita. </li><li> Quando la OD 600 = 0,2-0,3 (a 37 ° C con una coltura cellulare iniziale OD 600 = 0,02, ciò richiederà hr 3-4), iniziare a preparare il gel di agarosio pad (passo 3). </li><li> Le cellule sono pronte per l&#39;imaging quando OD <sub&gt; 600 = 0,3-0,4. </li><li> Trasferire 1 ml di coltura incubata in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 10.000 xg per 1 min in microcentrifuga. </li><li> Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di terreno fresco M9 e risospendere il pellet delicatamente. </li><li> Centrifugare a 10.000 xg per 1 min. </li><li> Ripetere il punto 1.6 e 1.7. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere delicatamente in 1 ml di M9 media. Cellule può essere direttamente utilizzata per l&#39;imaging microscopio o diluito 10 - a 100 volte per garantire densità cellulari bassi per l&#39;imaging timelapse. Notare che basse densità cellulari sono importanti per l&#39;imaging timelapse esteso. La camera di imaging (fase 4) è sigillata durante l&#39;esperimento. A causa della crescita esponenziale di cellule, elevate concentrazioni iniziali di cellule può significativamente esaurire l&#39;ossigeno all&#39;interno della camera di crescita dopo prolungata nel cuscinetto di gel, riducendo maturazione proteina fluorescente e influenzando la crescita cellulare. </li></ol> 3. Preparare la soluzione di agarosio <ol><li> Pesare 10-20 mgbassa temperatura di fusione agarosio in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. </li><li> Aggiungere mezzo adeguato volume minimo M9 senza antibiotici per ottenere una soluzione al 3% di agarosio. </li><li> Riscaldare la soluzione di agarosio per 30 minuti a 70 ° C per fondere, invertendo la provetta per garantire che la soluzione è completamente fusa e omogenea. Il cuscinetto di gel può essere versato a questo punto (passo 4) o la temperatura può essere ridotta a 50 ° C e mantenuta per diverse ore per un uso successivo. </li></ol> 4. Preparare Pad Gel sulla Camera <ol><li> Circa 50 minuti prima di imaging, lavare uno scivolo Microaqueduct con acqua. </li><li> Risciacquo uno pulito vetro di copertura (utilizzando un metodo rigoroso di pulizia come quello descritto in 6) e Microaqueduct scivolo con acqua sterile e asciugare soffiando con aria compressa. </li><li> Posizionare la guarnizione di gomma sul vetrino Microaqueduct modo che copra le entrate e le uscite sul lato del vetro scorrevole Microaqueduct (questo può essere modificato per applicazioni inquale supporto è perfuso attraverso il campione). Applicare 50 ul di soluzione di agarosio (step 3) al centro della slitta Microaqueduct. </li><li> Top la soluzione di agarosio con la pulizia, vetro di copertura a secco. </li><li> Lasciare la soluzione di agarosio riposare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Nel frattempo, preparare un campione di cellule (fase 2). </li><li> Attentamente staccare il vetro di copertura dalla parte superiore del cuscinetto di gel. Aggiungere 1,0 microlitri coltura cellulare lavato per la parte superiore del cuscinetto di gel. Attendere ~ 2 min per la coltura di essere assorbita dal cuscinetto di gel. E &#39;importante non aspettare così a lungo che le overdries gel pad, ma abbastanza a lungo che le cellule siano correttamente rispettate il cuscinetto di gel. Il tempo ideale di attesa varia a seconda della temperatura e dell&#39;umidità. </li><li> In attesa, asciugare un altro bicchiere predepurata copertura. </li><li> Coprire il campione con il vetro di copertura nuova assicurare che il vetro e il coperchio scorrevole Microaqueduct sono ben allineati. </li><li> Montare la camera di crescita della temperatura controllata seguendo le istruzioni del produttore.Si può ora essere utilizzato per l&#39;imaging su microscopio (passo 5). </li></ol> 5. Acquisizione di immagini e filmati Timelapse <ol><li> Accendere il microscopio laser e seguendo le istruzioni del produttore (ad esempio, il laser potrebbe essere necessario riscaldato per ~ 0,5 ore prima dell&#39;esperimento). </li><li> Bloccare la camera montata per l&#39;inserto sul palco microscopio. Impostare la temperatura della camera di crescita e il riscaldatore obiettivo a 37 ° C o altra temperatura di crescita desiderata. </li><li> Se l&#39;imaging sopra della temperatura ambiente, la messa a fuoco o cuscinetto di gel di solito deviare significativamente per ~ 15 minuti dopo il turno temperatura iniziale. In pratica, utilizzare questo tempo per trovare le regioni di interesse e modificare gli script di imaging, se necessario, per un esperimento. </li><li> Trova celle del microscopio e memorizzare la posizione di ciascuna cella dopo centrandolo all&#39;interno di una regione imaging predefiniti e allineati. Più di una cella può essere ripreso in ciascuna finestra di tempo di acquisizione dell&#39;immagine. Per timelapse di imaging su mtutte le generazioni, in modo che le cellule sotto forma di immagini sono inizialmente separati da altre cellule di almeno qualche centinaio di micron in modo che altre colonie non entrerà nella regione di imaging durante la crescita. </li><li> Regolare intensità del laser di eccitazione in modo che quasi tutti fotosbiancante molecole fluorescenti entro 6 esposizioni (Figura 5). </li><li> Utilizzo di uno script automatico di imaging / rivista, acquisire i dati timelapse utilizzando l&#39;algoritmo descritto nel flusso di lavoro sperimentale in Figura 3. </li></ol>

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	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Non abbiamo informazioni integrative.

Il metodo CoTrAC può essere generalizzato per misurare la produzione di altre proteine ​​con N-convenzionali o C-terminali fusioni proteine ​​fluorescenti possono alterare l&#39;attività della proteina. La strategia CoTrAC ha tre vantaggi unici rispetto ai metodi attuali. First, co-traslazionale fusione assicura che una molecola del reporter fluorescente viene prodotta per ogni molecola di proteina di interesse, permettendo conteggio preciso della produzione di proteina in tempo reale. In secondo luogo, la mem...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Agarosio (bassa temperatura di fusione) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × sali M9 </td><td></td><td></td><td> Ricetta seguito descritto in 9 </td></tr><tr><td> 20% di glucosio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM soluzione di aminoacidi </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controllata di crescitaCamera Fase adattatore </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldatore Obiettivo </td><td> Bioptechs </td><td> Modello dipende obiettivo microscopio </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct diapositiva </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto Micro </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Può essere difficile da fonte, disponibile anche da Bioptechs </td></tr><tr><td> Copertura in vetro / slide guarnizione </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 millimetri </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Vario </td><td> Esempio di installazione: Coherent Innova 308C Argon-laser a ioni, Olympus IX-81 microscopio, Olympus Planapo 100X NA 1,45 obiettivo, software Metamorph </td><td> Deve avere eccitazione del laser, automatizzato fase xyz, software di automazione in grado di imaging script e autofocus, ottica in grado di resolving singole proteine ​​fluorescenti </td></tr><tr><td> EM-CCD </td><td> Vario </td><td> Esempio di installazione: Andor Ixon DU-898 </td><td> Deve avere rumore sufficientemente basso per rilevare singole proteine ​​fluorescenti sopra sfondo </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC) per l&#39;immagine della produzione di molecole di proteine ​​in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo permette di contare il numero di molecole di proteine ​​prodotte in una cella durante sequenziali, cinque minuti finestre temporali. Si richiede un microscopio a fluorescenza con densità di potenza laser di eccitazione di ~ 0,5 a 1 kW / cm 2, che è sufficientemente sensibile per rivelare singole molecole di proteine ​​fluorescenti in cellule vive. Il reporter fluorescente utilizzata in questo metodo si compone di tre parti: una sequenza di targeting membrana, una rapida maturazione, proteina fluorescente gialla e una sequenza di riconoscimento proteasi. Il reporter è traduzionalmente fusa all&#39;N-terminale di una proteina di interesse. Le cellule vengono coltivate su un temperatura controllata portaoggetti. Ogni cinque minuti, le molecole fluorescenti all&#39;interno delle cellule vengono esposte (e poi counted analizzando le immagini di fluorescenza) e, successivamente, in modo che le proteine ​​photobleached solo appena tradotti sono conteggiati nella misura successiva. Immagini di fluorescenza risultanti da tale metodo può essere analizzato rilevando macchie fluorescenti in ogni immagine, assegnando loro singole celle e quindi assegnare cellule per linee cellulari. Il numero di proteine ​​prodotte entro una finestra temporale in una data cella è calcolato dividendo l&#39;intensità di fluorescenza delle macchie integrato per l&#39;intensità media di singole molecole fluorescenti. Abbiamo usato questo metodo per misurare i livelli di espressione nella gamma di 0-45 molecole in finestre singole 5 min di tempo. Questo metodo consente di misurare il rumore nell&#39;espressione del repressore λ CI, e ha molte altre applicazioni potenziali in biologia dei sistemi.

Risultati tipici di un esperimento CoTrAC tracciamento della produzione del repressore λ CI sono mostrati nelle Figure 4 e 5. In questo esperimento, sono stati ripresi 12 colonie a intervalli di 5 min. Ad ogni punto di tempo, la colonia fu autofocused e centralizzato all&#39;interno della regione di imaging. Successivamente, l&#39;centrato / focalizzato posizione è stata memorizzata e l&#39;immagine è stata acquisita campo chiaro. Lo stadio è stato poi traslocato da ~ 0,5 micron lun...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC), per l&#39;immagine della produzione di molecole di proteine ​​in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo è stato utilizzato per seguire la dinamica stocastica espressione di un fattore di trascrizione, il repressore λ CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

9.8K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC), per l'immagine della produzione di molecole di proteine ​​in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo è stato utilizzato per seguire la dinamica stocastica espressione di un fattore di trascrizione, il repressore λ CI 1.