作者要感谢马修佛罗伦萨准备的海马切片培养。这项工作是由美国国家老龄问题研究所和阿尔茨海默氏症协会NZG补助。

1。固定术固定剂是致癌物质，戴手套，在通风橱中的固定剂处理。除非另有说明，所有的孵化做冰，所有的解决方案在使用前，应进行过滤。使用电子显微镜级试剂。 第1天<ol><li class="jove_content">后的实验条件下（ 例如，病毒注射剂，药物治疗），将膜与器官型海马切片，在60×15mm的聚苯乙烯培养皿中含有冰冷的0.1M的磷酸盐缓冲液（索伦森的磷酸盐缓冲液），pH值为7.3。加入1 - 2毫升0.1M磷酸盐缓冲液直接在顶部的切片，以保持它们的冷。 </li></ol> 关键的步骤： 请务必使用新鲜配制的缓冲和固定剂。确保的缓冲液的pH值是在所需的范围之内。一个不这样做可能会破坏细胞结构。 <ol start="2"><li>片CA1区的隔离，使用一次性解剖刀轻轻横切旁边切片到DG，CA1区细胞层（ 图1）平行。然后切剩下的片垂直删除CA3区和下托。切的切片，以帮助识别组织的顶表面上的一个角落。 </li></ol> 注：在没有病毒交付兴趣蛋白质的情况下是必需的，可以是固定的整个组织切片，用温和的冰冷的缓冲液冲洗后，除去介质。然后这之后是通过切出的CA1。 关键的步骤： 跟踪的上部的组织，以适当的网格切片上。 <ol start="3"><li>小心地取出的组织，从膜中使用的背面侧的手术刀。使用巴斯德吸液管轻轻地组织转移到含12孔板的0.1M磷酸盐缓冲液。 </li><li>在井中取出缓冲从板，并添加500米ü;升 - 1毫升冰冷的固定剂（pH 7.3）的组成如下：0.1％苦味酸，1％多聚甲醛和2.5％戊二醛在0.1M磷酸盐缓冲液。孵育2小时，在4℃下</li></ol> 注：苦味酸干燥时可能会爆炸。保持湿润​​密闭容器中的水。应贮存在干燥，通风良好的地方。 <ol start="5"><li>移除固定液从井和洗涤样品在0.1M磷酸盐缓冲液中的3次（每次20分钟）。 </li><li>孵育40分钟，在1％的单宁酸（重量/体积），在0.1M马来酸缓冲液，pH6.0。 </li><li>马来酸盐缓冲液中冲洗两次（每次20分钟）。 </li><li>在1％乙酸双氧铀（重量/体积）在黑暗中马来酸盐缓冲液中孵育40分钟。醋酸铀对光很敏感，是放射性的。量用Parafilm的烧杯中溶解时，在4℃下存放任何未使用的缓冲液在黑暗</li><li>马来酸盐缓冲液中冲洗两次（每次20分钟）。 </li><li>孵育20分钟，在0.5％铂氯碱IDE（重量/体积）马来酸盐缓冲液中。 </li><li>马来酸盐缓冲液中冲洗两次（每次20分钟）。将样品储存在4℃下直到他们准备好以供进一步处理。 </li></ol> 2。脱水和嵌入环氧丙烷是致癌物质。避免蒸气，在通风橱中工作。使用绝对的，100％纯乙醇，不包含任何水迹。这绝对乙醇稀释到不同浓度的脱水。 第2天<ol><li>孵育5分钟，在50％乙醇中，然后在70％乙醇中的5分钟。 </li><li>在新鲜制备的1％，在70％乙醇中的对苯二胺（PPD）孵育15分钟。 </li><li>在70％乙醇中冲洗三次。 </li><li>孵育5分钟，在80％乙醇中，然后在95％乙醇中的5分钟。 </li><li>在100％的乙醇中温育两次每次5分钟。 </li><li>准备带螺丝帽的玻璃小瓶，并确保它们是干净和完全干燥。将切片，玻璃瓶和简单而清楚地标示每小瓶。 </li><li>孵育5分钟，在1:1的乙醇：氧化丙烯。 </li><li>孵育在100％氧化丙烯两次每次5分钟。 </li><li>加入树脂（EPON），每个管形瓶中，使与环氧丙烷的1:1混合物。轻轻搅拌2小时。不要摇晃瓶太严格，以防止泡沫，可能会干扰嵌入。 </li><li>将树脂以3:1的混合物与环氧丙烷，和混合2小时。 </li><li>转移到100％的树脂，并培育O / N。 </li></ol>第3天<ol start="12"><li>夹层之间的采样条状的的ACLAR塑料和固化24小时在60℃下</li></ol> 3。切割和安装在网格第4天<ol><li>剪切半薄（0.5微米）的部分，和染色，用1％甲苯胺蓝+ 1％硼砂，以确定样本的正确方向。 </li><li>切割超薄切片（60纳米）和安装在镍网格，每个网格的一个部分。 </li></ol>4。免疫组化所有的缓冲液和水在使用前，应进行过滤。 第5天<ol><li>将下降（〜50微升）的1％Tween-20/phosphate缓冲液（T / PB），pH为7.5，在平坦的表面上一块干净的封口膜。用干净的镊子轻轻拿起电网的边缘，浮动缓冲区，节下来，并在室温下孵育10分钟。 </li><li>沥干多余的液体从电网通过载置部侧上的滤纸，然后浮于50mM甘氨酸在T / PB 15分钟，在RT。 </li></ol> 关键步骤：为了避免过度的“进位”在孵育期间溶液液滴从一个到下一个的解决方案中，排出多余的液体通过轻轻触摸网格的边缘到＃1滤纸每个解决方案之间变化。同时删除任何解决方案被困在两臂之间的EM钳轻轻一小块滤纸之间的钳子武器排汗电网，同时可确保响的部分不完全干燥。 <ol start="3"><li>用滤纸擦干电网，然后漂浮在封闭液含2.5％BSA和2.5％血清的30分钟，在RT下的二次抗体在T / PB从该动物。 </li><li>孵育在4℃下与第一抗体（在T / PB）在RT或O / N的最佳时间和保温温度，以及抗体的浓度，需要实验确定。 </li><li>网格洗净3次（每次2分钟）与T / PB。 </li><li>在RT下的1小时的二次抗体（1:20抗兔或抗小鼠耦合到10 nm的金）孵育。 </li><li> T / PB洗3次（每次2分钟）。 </li><li> Postfix和2％戊二醛在T / PB 5分钟。 </li><li> T / PB，然后三次（2分钟），用过滤水清洗3次（每次2分钟）。 </li><li>孵育在水中10分钟，用2％乙酸双氧铀。 </li></ol>而电网染色，准备一个CO 2室placin嘎一块石蜡膜的玻璃陪替氏培养皿的中心。然后放置在盘4-6的NaOH粒料周围封口膜在空气中的CO 2的吸收。保持顶部封闭了几分钟。使用巴斯德吸管，并迅速转移雷诺的柠檬酸铅溶液的封口膜在玻璃陪替氏培养皿中的一个小体积的。打开顶盖，就足以插入巴斯德吸管，以减少CO 2的重新引入到室内。 注：为了使雷诺的柠檬酸铅溶液，煮沸100毫升去离子水在微波炉中，在一个密闭的容器中，放凉。在与止动件50毫升容量瓶中，混合1.33克硝酸铅，1.76克柠檬酸钠和30毫升的开水剧烈振摇1分钟。然后摇间歇30分钟。这浑浊的溶液中，加入8毫升的1 M氢氧化钠烧瓶中，慢慢地倒置了几次。解决方案将变得清晰起来。使溶液至50毫升与煮娃之三。紧紧密封存储解决方案。如果沉淀物出现，丢弃，使一个新的。 <ol start="11"><li>在三个小烧杯准备温暖，刚煮沸的去离子水。洗掉的醋酸铀浸在电网中的第一个烧杯中，轻轻摇动30秒左右。重复此步骤，在其他两个烧杯中。 </li><li>打开的玻璃陪替氏培养皿的顶部刚好够放置在网格上的下拉雷诺柠檬酸铅溶液。如果可能的话，要戴上口罩，而这样做是为了避免呼吸柠檬酸铅和防止沉淀物的形成。孵育10分钟。 </li><li>打开顶盖，就足以消除电网。避免吸入柠檬酸铅。三次浸渍，依次在三个烧杯用温水，刚煮沸的蒸馏水洗净电网。在一张滤纸，条达，让电网干燥的。现在已准备好用于电子显微镜的样品。 </li></ol>

<ol>
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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li><li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. 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我们什么都没有透露。

在这个协议中，我们采取了Phend和Weinberg方法，对大脑和脊髓组织，研究在大鼠海马脑片培养的树突棘。在海马CA3-CA1区树突棘是脆弱的结构，包含一个庞大的多种蛋白质中发挥重要作用，在调节神经功能。所提出的方法提供了一个平衡的方法，用于实现增强的抗原性，同时保持良好的的超微结构保存（图2A），允许合理的标记效率和良好的再现性，可用于脊柱内的特定抗原的分布特征?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

在亚细胞水平研究生物分子免疫电镜是一个功能强大的工具。耦合到电子致密如胶体金标记的抗体，可以揭示在各种组织中的特定的抗原1的定位和分布。两个最广泛使用的技术是预嵌入和嵌入后的技术。在预嵌入免疫金电子显微镜（EM）技术中，组织必须透性以允许抗体渗透之前，它被嵌入。这些技术是理想的保护结构，而且渗透力差的抗体（通常只有几微米）是一个很大的缺点2。后嵌入标记方法可以避免这个问题，因为标签上发生的部分固定的组织抗原更容易获得。多年来，多次修改，完善后的嵌入方法，以提高免疫，并保留超微结构<suP&gt; 3-5。 组织固定EM研究的重要组成部分。固定剂的化学交联的大分子锁定的组织结构。固色剂的选择不仅影响结构保存，但也抗原性和对比度。几十年来，四氧化锇（OSO 4），甲醛，和戊二醛已被标准的固定剂，包括中枢神经系统（CNS）的组织，尤其是在化学和物理处理过程中容易产生结构损伤。不幸的是，OSO 4是反应性高的，并已被证明，以掩盖抗原6，从而导致在穷人和不足的标签。替代方法来避免化学固定，包括冻结的组织。但是，这些技术是难以执行，并需要昂贵的仪器。为了解决这些问题中的某些问题，并提高CNS组织标签，Phend 等 。 OSO 4醋酸铀（UA）和单宁的ACI代替D（TA），并成功地引入了额外的修改，以提高抗原检测的敏感性和结构保存在大脑和脊髓组织7。我们都采用了这种锇后埋线法对大鼠脑组织和优化的探测和研究突触蛋白的免疫胶体金标记技术。 我们在座的方法来确定大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的超微结构定位。我们使用海马切片培养的切片。这些切片保持的trisynaptic的的电路的海马，从而学习突触可塑性是特别有用的，一个机制，人们普遍认为，学习和记忆的基础。如前所述8，可以制备从出生后的第5和6天小鼠/大鼠幼仔器官型海马切片，以及急性击倒或过度表达的外源蛋白是特别有用的。我们以前使用过该协议的通道aracterize的NG（NG），神经元特异性蛋白的关键作用，在调节突触功能8,9。我们还用它来 ​​描述的超微结构定位钙调素（CAM）和Ca 2 + /钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）10。所示的结果，该协议允许的树突棘超微结构的保存和高效的标签，吴，，帮助刻画其分布在脊柱8。此外，这里所描述的过程可以有广泛的适用性，在研究参与神经元功能的许多其他蛋白质。

图2B示出的一个例子的内源性伍分子分布在海马CA1区锥体神经元树突棘。与超薄（60 nm）的组织中的海马CA1区域的（如在图2A中可见）的镍网格覆盖在1％T / PB，50mM甘氨酸，然后，用2.5％BSA和2.5％血清阻塞之前，用抗孵育-吴抗体。洗涤后，使用T / PB，网格，然后覆盖在耦合到10nm的金的抗兔第二抗体。最后，网格，用T / PB后缀为2％戊二醛2％醋酸铀和雷诺的柠檬酸铅染色，?...

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

蛋白质的定位和分布提供了重要的信息，了解他们的细胞功能。可以使用电子显微镜（EM）的优越的空间分辨率，以确定一个给定的抗原后免疫组化的亚细胞定位。对于组织的中枢神经系统（CNS），保持结构完整性的同时保持抗原性已经在EM研究特别困难。在这里，我们采用的程序已经被用来保存在中枢神经系统的研究和定性大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的结构和抗原。

嵌入后突触蛋白的免疫标记海马切片培养

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

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Neuroscience

17.0K 次观看.  Medical College of Wisconsin. 蛋白质的定位和分布提供了重要的信息，了解他们的细胞功能。可以使用电子显微镜（EM）的优越的空间分辨率，以确定一个给定的抗原后免疫组化的亚细胞定位。对于组织的中枢神经系统（CNS），保持结构完整性的同时保持抗原性已经在EM研究特别困难。在这里，我们采用的程序已经被用来保存在中枢神经系统的研究和定性大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的?...