Los autores desean agradecer a Mateo Florencia para la preparación de los cultivos de cortes de hipocampo. Este trabajo fue apoyado por becas de EE.UU. Instituto Nacional sobre el Envejecimiento y la Asociación de Alzheimer para NZG.

1. Fijación Los fijadores son cancerígenos; use guantes y manejar los fijadores en una campana de humos. A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones se realizan sobre hielo y todas las soluciones debe ser filtrado antes de su uso. El uso de electrones microscopía de grado-reactivos. Día 1 <ol><li class="jove_content"> Después de condiciones experimentales (por ejemplo, inyección viral, el tratamiento farmacológico), colocar la membrana con organotípicos de cortes de hipocampo en un 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri que contiene enfriado con hielo 0,1 M de tampón fosfato (tampón fosfato de Sorensen), pH 7,3. Añadir 1 a 2 ml de tampón fosfato 0,1 M directamente en la parte superior de las rodajas para mantenerlos fríos. </li></ol> PASO FUNDAMENTAL: Siempre use amortiguadores recién preparados y fijadores. Asegúrese de que el pH del tampón está dentro del rango deseado. El hecho de no hacerlo puede dañar las estructuras celulares. <ol start="2"><li> Para aislar el subcampo CA1 de la rebanada, utilizar undesechable bisturí para cortar suavemente a través de la porción próxima a la DG, paralela a la capa de células CA1 (Figura 1). A continuación, corte la porción restante verticalmente para eliminar el subcampo CA3 y la subículo. Cortar una esquina de la rebanada para ayudar a identificar la superficie superior del tejido. </li></ol> NOTA: En caso de no entrega viral de la proteína de interés se requiere, la lámina de tejido entero puede ser fijado después de que el soporte se extrae con un enjuagado suave de tampón enfriado con hielo. Esto es seguido por corte de la CA1. Paso crítico: un seguimiento de la parte superior del tejido con el fin de seccionamiento adecuado de las rejillas más adelante. <ol start="3"><li> Retire cuidadosamente el tejido de la membrana utilizando la parte trasera del bisturí. Utilizar una pipeta Pasteur para transferir suavemente el tejido a una placa de 12-pocillos que contenía 0,1 M de tampón fosfato. </li><li> Eliminar el tampón en el pocillo de la placa y añadir 500 &amp; mu; l - 1 ml de helado de fijador (pH 7,3) compuesto de los siguientes: 0,1% de ácido pícrico, 1% de paraformaldehído, y 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M tampón fosfato. Incubar durante 2 horas a 4 ° C. </li></ol> NOTA: El ácido pícrico puede ser explosivo cuando está seco. Manténgalo humedecido con agua en un recipiente herméticamente cerrado. Guárdelo en un lugar seco y bien ventilado. <ol start="5"><li> Retire el fijador del pozo y lavar las muestras 3 veces (20 min cada uno) en 0,1 M tampón fosfato. </li><li> Incubar durante 40 min en 1% de ácido tánico (w / v) en tampón de maleato 0,1 M, pH 6,0. </li><li> Enjuague dos veces (20 min cada una) en tampón de maleato. </li><li> Incubar durante 40 min en acetato de uranilo al 1% (w / v) en tampón de maleato en la oscuridad. Acetato de uranilo es sensible a la luz y es radiactivo. Cubrir el vaso con Parafilm cuando se disuelve y almacenar cualquier tampón utilizado en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Enjuague dos veces (20 min cada una) en tampón de maleato. </li><li> Incubar durante 20 min en cloro platino 0,5%ide (w / v) en tampón de maleato. </li><li> Enjuague dos veces (20 min cada una) en tampón de maleato. Almacenar las muestras a 4 º C hasta que estén listos para su posterior procesamiento. </li></ol> 2. La deshidratación y la incrustación El óxido de propileno es cancerígeno. Evite los vapores al trabajar con ella en una campana de humos. El uso de etanol absoluto, 100% puro que no contiene ninguna traza de agua. Diluir esta etanol absoluto para producir diferentes concentraciones de deshidratación. Día 2 <ol><li> Incubar durante 5 min en etanol al 50% y después de 5 min en etanol al 70%. </li><li> Incubar durante 15 min en 1% recién preparada p-fenilendiamina (PPD) en 70% de etanol. </li><li> Enjuague tres veces en etanol al 70%. </li><li> Incubar durante 5 min en 80% de etanol y después de 5 min en etanol al 95%. </li><li> Incubar en 100% de etanol dos veces 5 min cada uno. </li><li> Preparar viales de vidrio con tapón de rosca y asegúrese de que estén limpios y completamente secos. Transferir las rebanadas a viales de vidrio yetiquetar cada vial simple y clara. </li><li> Incubar durante 5 min en 1:1 etanol: óxido de propileno. </li><li> Incubar en óxido de propileno 100% dos veces 5 min cada uno. </li><li> Añadir resina (Epon) a cada vial para hacer una mezcla 1:1 con óxido de propileno. Mezclar suavemente durante 2 horas. No agite los viales demasiado rigurosa para evitar las burbujas que puedan interferir con incrustación. </li><li> Añadir resina para hacer una mezcla 3:1 con óxido de propileno, y se mezcla durante 2 h. </li><li> Traslado al 100% de resina e incubar S / N. </li></ol> Día 3 <ol start="12"><li> Muestras Sandwich entre tiras de plástico ACLAR y cura durante 24 horas a 60 º C. </li></ol> 3. De sección y de montaje en Grids Día 4 <ol><li> Cortar semi-delgadas (0,5 micras) y las secciones se tiñen con azul de toluidina al 1% + 1% de bórax para determinar la orientación correcta de muestras. </li><li> Cortar secciones ultrafinas (60 nm) y montar en rejillas de níquel, una sección por la red. </li></ol>4. La inmunohistoquímica Todos los tampones y el agua debe ser filtrada antes de su uso. Día 5 <ol><li> Colocar una gota (~ 50 l) de tampón de Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, en un trozo de Parafilm limpias sobre una superficie plana. Suavemente levante el grid con pinzas limpias por el borde y flotar en el búfer, sección hacia abajo, y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Drenar el exceso de líquido de la red mediante la colocación de lado de la sección hacia arriba sobre papel de filtro y, a continuación flotan en 50 mM de glicina en T / PB durante 15 min a RT. </li></ol> PASO FUNDAMENTAL: Para evitar la excesiva &quot;carry-over&quot; de soluciones de gota solución de una a otra durante las incubaciones, drenar el exceso de líquido tocando suavemente el borde de la red # 1 en papel de filtro entre cada cambio de solución. También quite cualquier solución atrapado entre los brazos de la EM Pinzas de sujeción de la red por capilaridad suavemente con un trozo de papel de filtro entre los brazos de pinzas mientras ensutocar las partes no se sequen completamente. <ol start="3"><li> Secar la rejilla con papel de filtro y, a continuación flotan en la solución de bloqueo que contiene 2,5% de BSA y 2,5% el suero del animal del anticuerpo secundario en T / PB durante 30 min a RT. </li><li> Incubar con anticuerpo primario (en T / PB) a TA o O / N a 4 º C. El tiempo óptimo y la temperatura de incubación, así como la concentración de anticuerpos, necesita ser determinado experimentalmente. </li><li> Lavar la rejilla de tres veces (2 min cada una) con T / PB. </li><li> Incubar con anticuerpo secundario (1:20 anti-conejo o anti-ratón acoplado a oro nm 10) durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar tres veces (2 min cada una) con T / PB. </li><li> Postfix con 2% de glutaraldehído en T / PB durante 5 min. </li><li> Lavar tres veces (2 min cada una) con T / PB y luego tres veces (2 min cada una) con agua filtrada. </li><li> Incubar con acetato de uranilo al 2% en agua durante 10 min. </li></ol> Aunque la red está manchando, prepare un CO 2-cámara libre por placingc trozo de Parafilm en el centro de una placa Petri de vidrio. A continuación, coloque 4-6 pastillas de NaOH en el plato todo el Parafilm para absorber el CO 2 en el aire. Mantener la parte superior cerrada durante unos pocos minutos. Utilizar una pipeta Pasteur y transferir rápidamente un pequeño volumen de solución de citrato de plomo de Reynold para la Parafilm en el plato Petri de vidrio. Abrir la tapa lo suficiente para insertar la pipeta Pasteur para minimizar la re-introducción de CO 2 en la cámara. NOTA: Para hacer una solución de citrato de plomo de Reynold, hervir 100 ml de agua desionizada en un horno de microondas y dejar enfriar en un recipiente hermético. En un matraz aforado de 50 ml con tapón, mezcla de 1,33 g de nitrato de plomo, 1,76 g de citrato sódico y 30 ml de agua hervida agitando vigorosamente durante 1 min. Luego agitar intermitentemente durante 30 min. A esta solución turbia, añadir 8 ml de hidróxido de sodio 1 M y lentamente invertir el matraz varias veces. Solución se hará claro. Llevar la solución a 50 ml con el wa hervidater. Guarde la solución cerrado herméticamente. Si aparece precipitado, desechar y hacer uno nuevo. <ol start="11"><li> En tres vasos más pequeños preparar agua caliente, desionizada recién hervida. Lavar el acetato de uranilo por inmersión de la rejilla en el primer vaso de precipitados y suavemente remolino alrededor de 30 seg. Repita este paso en los otros dos vasos de precipitados. </li><li> Abrir la parte superior de la cápsula Petri de vidrio sólo lo suficiente para colocar la rejilla en la gota de solución de citrato de plomo de Reynold. Si es posible, use una mascarilla mientras se hace esto para evitar respirar el citrato de plomo y evitar la formación de precipitado. Incubar durante 10 min. </li><li> Abra la tapa lo suficiente para quitar la rejilla. Evite respirar el citrato de plomo. Lavar la rejilla tres veces por inmersión secuencial en tres vasos de precipitados con agua tibia, destilada recién hervida. Que la rejilla seco en un trozo de papel de filtro, sección hacia arriba. La muestra está ahora lista para el microscopio electrónico. </li></ol>

<ol>
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Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses.">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique:+effects+of+processing+on+probe+distribution.">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li><li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. 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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections.">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li><li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+antigen,+one+gold?+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5'-nucleotidase+in+frozen+thin+sections.">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. 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R., Lonnie, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Electron Microscopy. 30, (1992).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. 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E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+phosphoprotein+B-50/GAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity.">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li><li>Maunsbach, A. A., Bjorn, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

En este protocolo, hemos adoptado el método Phend y Weinberg para el cerebro y los tejidos de la médula espinal para estudiar las espinas dendríticas en las culturas de ratas rebanada hipocampo. Las espinas dendríticas en el hipocampo CA3-CA1 área son delicadas estructuras que contienen una gran variedad de proteínas que desempeñan papeles importantes en la regulación de las funciones neuronales. El método presentado proporciona un enfoque equilibrado para lograr la antigenicidad mayor manteniendo al mismo tiem...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

Inmunomicroscopía es una herramienta poderosa para estudiar moléculas biológicas a nivel subcelular. Anticuerpos acoplados a marcadores densos en electrones tales como oro coloidal puede revelar la localización y distribución de antígenos específicos en diversos tejidos 1. Las dos técnicas más utilizadas son las técnicas de incrustación de pre-y post-inmersión. En inmuno-electrónica pre-incrustación de microscopía (EM) técnicas, el tejido debe ser permeabilizan para permitir la penetración de anticuerpos antes de que sea incorporado. Estas técnicas son ideales para la conservación de estructuras, pero pobre penetración del anticuerpo (a menudo sólo los pocos micrómetros primera) es un inconveniente considerable 2. Los métodos de marcaje post-incrustación puede evitar este problema, ya que el etiquetado se lleva a cabo en secciones de tejidos fijados donde los antígenos son más fácilmente accesibles. A través de los años, un número de modificaciones han mejorado los métodos de incrustación de post-inmunoreactividad para mejorar y preservar la ultraestructura <sup&gt; 3-5. Fijación tisular es una parte crucial de los estudios de EM. Fijadores químicamente reticular las macromoléculas para bloquear las estructuras de tejido en su lugar. La elección del fijador no sólo afecta a la conservación estructural, sino también la antigenicidad y el contraste. El tetróxido de osmio (OsO 4), formaldehído, glutaraldehído y han sido los fijadores estándar durante décadas, incluyendo para el sistema nervioso central (SNC) tejidos que son especialmente propensos a daños estructurales durante el tratamiento químico y físico. Desafortunadamente, OsO 4 es altamente reactivo y se ha demostrado para enmascarar antígenos 6, resultando en el etiquetado pobre e insuficiente. Enfoques alternativos para evitar la fijación química incluyen la congelación de los tejidos. Pero estas técnicas son difíciles de realizar y requieren instrumentación costosa. Para resolver algunos de estos problemas y para mejorar el etiquetado CNS tejido, Phend et al. reemplazado Oso 4 con acetato de uranilo (UA) y tánico acid (TA), introducido con éxito y modificaciones adicionales para mejorar la sensibilidad de detección del antígeno y la conservación estructural en tejidos del cerebro y la médula espinal 7. Hemos adoptado esta osmio sin post-incrustación método de tejido cerebral de rata y optimizado la técnica de inmuno-etiquetado para detectar y estudiar las proteínas sinápticas. Se presenta aquí un método para determinar la localización ultraestructural de las proteínas sinápticas del hipocampo de rata en las neuronas piramidales CA1. Utilizamos organotípicos rebanadas de hipocampo en cultivo. Estas rodajas mantener la circuitería trisynaptic del hipocampo, y por lo tanto son especialmente útiles para el estudio de la plasticidad sináptica, un mecanismo ampliamente cree que la base de aprendizaje y memoria. Organotípicos rebanadas de hipocampo de días postnatales 5 y 6 de ratón / rata cachorros se pueden preparar como se ha descrito previamente 8, y son especialmente útiles para agudamente desmontables o sobreexpresan proteínas exógenas. Anteriormente hemos utilizado este protocolo para characterize neurogranina (Ng), una proteína específica de neuronas con un papel crítico en la regulación de la función sináptica 8,9. También lo hemos utilizado para caracterizar la localización ultraestructural de la calmodulina (CaM) y Ca 2 + / CaM dependiente de la proteína quinasa II (CaMKII) 10. Como se ilustra en los resultados, este protocolo permite una buena conservación ultraestructural de las espinas dendríticas y el etiquetado eficiente de Ng para ayudar a caracterizar su distribución en la columna 8. Además, el procedimiento aquí descrito puede tener una amplia aplicación en el estudio de muchas otras proteínas que participan en las funciones neuronales.

La Figura 2B muestra un ejemplo de la distribución de moléculas endógenas NG en las espinas dendríticas de las neuronas piramidales CA1 del hipocampo. Rejillas de níquel con ultrafinos (60 nm) tejidos que contienen la región CA1 del hipocampo (como se ve en la Figura 2A) se trataron en 1% T / PB, 50 mM glicina, luego se bloquearon con 2,5% de BSA y 2,5% de suero antes de la incubación con anti anticuerpo-Ng. Después de lavar con T / PB, rejillas se cubrieron entonces en anti-con...

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialmente difícil en los estudios de EM. Aquí, se adopta un procedimiento que ha sido utilizado para preservar las estructuras y los antígenos en el SNC para estudiar y caracterizar proteínas sinápticas del hipocampo de rata en las neuronas piramidales CA1.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K vistas.  Medical College of Wisconsin. La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialm...