המחברים מבקשים להודות למתיו פירנצה להכנה של התרבויות הפרוסות ביפוקמפוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי להזדקנות בארה&quot;ב ואיגוד האלצהיימר לNZG.

1. קבעון Fixatives הם מסרטנים; ללבוש כפפות ולטפל בfixatives במנדף. אלא אם צוין אחרת, כל incubations נעשה על קרח ואת כל הפתרונים צריכים להיות מסוננים לפני השימוש. השתמש ריאגנטים אלקטרונים מיקרוסקופים בדרגה. יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי תנאי ניסוי (למשל הזרקה נגיפית, טיפול תרופתי), הצב את הקרום עם פרוסות ביפוקמפוס organotypic ב60 x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי קלקר המכילה 0.1 מ &#39;פוספט חיץ קר כקרח (חיץ פוספט של סורנסן), 7.3 pH. הוסף 1-2 מ&quot;ל של חיץ פוספט 0.1 מ &#39;ישירות על גבי הפרוסות כדי לשמור אותם קר. </li></ol> שלב קריטי: השתמש תמיד במאגרים טריים וfixatives. ודא pH של המאגר נמצא בטווח רצוי. כישלון לעשות זאת יכול לגרום ניזק למבנים תאיים. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד את תת שדה CA1 של הפרוסה, השתמשאזמל חד פעמי בעדינות לחצות את הפרוסה הבאה לDG, במקביל לשכבת CA1 התא (איור 1). לאחר מכן לחתוך את הפרוסה אנכית שנותרה כדי להסיר CA3 subfield וsubiculum. חותך פינה של הפרוסה כדי לזהות את המשטח העליון של הרקמה. </li></ol> הערה: במקרה שאין אספקה ​​ויראלי של חלבון של עניין נדרשה, פרוסת הרקמה השלמה יכולה להיות קבועה אחרי התקשורת מוסרת עם שטיפה עדינה של חיץ קר כקרח. אז זה אחריו לחתוך את CA1. שלב קריטי: עקוב אחר בצד העליון של הרקמה על מנת שחתך נכון של הרשתות בשלב מאוחר יותר. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הרקמה מהקרום באמצעות הישבן של האזמל. השתמש פיפטה פסטר עדינות להעביר את הרקמות לצלחת המכילה גם 12-חיץ פוספט M 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיץ בבאר מהצלחת ולהוסיף 500 &amp; Mu; l - 1 המ&quot;ל של מקבע קר כקרח (pH 7.3) מורכבים מהפעולות הבאות: 0.1% חומצת picric, 1% paraformaldehyde, ו -2.5% בglutaraldehyde חיץ פוספט 0.1 מ &#39;. דגירה עבור 2 שעות ב 4 ° C. </li></ol> הערה: חומצת Picric עשויה להיות נפיצה כשהיא יבש. שמור את זה הורטב במים במכל הסגור היטב. אחסן במקום יבש ומאוורר היטב. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המקבע מהבאר ולשטוף דגימות 3 פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ פוספט 0.1 מ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 40 דקות בחומצה טאנית% 1 (w / v) במאגר 0.1 מ &#39;maleate, 6.0 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ maleate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 40 דקות ב1% יצטטו uranyl (w / v) במאגר maleate בחושך. תצטט Uranyl הוא רגיש לאור והוא רדיואקטיבי. לכסות את הכוס בParafilm כשההמסה ולאחסן את כל מאגר שאינו בשימוש בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ maleate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 20 דקות ב0.5% chlor פלטינהIDE (w / v) במאגר maleate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים (20 דקות כל אחד) בחיץ maleate. אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לעיבוד נוסף. </li></ol> 2. התייבשות והטבעה פרופילן אוקסיד הוא מסרטן. הימנע מאדים על ידי עבודה עימו במנדף. השתמש 100% אתנול מוחלט, טהור, שאין בי עקבות של מים. למהול אתנול מוחלט זה כדי לייצר ריכוזים שונים להתייבשות. יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות באתנול 50% ולאחר מכן במשך 5 דקות באתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות בp-phenylenediamine% מוכנים טרי 1 (PPD) באתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף שלוש פעמים באתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות באתנול 80% ולאחר מכן במשך 5 דקות באתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה באתנול 100% כפולים 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בקבוקוני זכוכית עם פקקי בורג ולוודא שהם נקיים ויבשים לחלוטין. העברת פרוסות לבקבוקוני זכוכית ולתייג כל בקבוקון צורה פשוטה וברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב01:01 אתנול: פרופילן אוקסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב100% פרופילן אוקסיד פעמים 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שרף (EPON) לכל בקבוקון לעשות תערובת ביחס 1:1 עם פרופילן אוקסיד. לערבב בעדינות ל2 שעות. אל תנענע את הבקבוקונים מדי בקפדנות כדי למנוע בועות שעלולים להפריע להטבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שרף לעשות תערובת 03:01 עם פרופילן אוקסיד, ותערובת ל2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לשרף 100% ולדגור O / נ </li></ol> יום 3 <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות סנדוויץ&#39; בין רצועות הפלסטיק ותרופה ל24 שעות ACLAR ב 60 ° C. </li></ol> 3. תבתר והרכבה ברשתות יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך (0.5 מיקרומטר) חלקי חצי דק וכתם% toluidine כחול 1 + 1% בורקס לקבוע את הכיוון הנכון של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך קטעי Ultrathin (60 ננומטר) ולהרכיב על רשתות ניקל, בסעיף 1 לרשת. </li></ol>4. אימונוהיסטוכימיה כל המאגרים והמים צריכים להיות מסוננים לפני השימוש. יום 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפה (~ 50 μl) של 1% חיץ Tween-20/phosphate (ט / PB), 7.5 PH, על פיסת Parafilm הנקי על משטח שטוח. לוקחים בעדינות את הרשת עם מלקחיים נקיים על השפה ושתצוף על החיץ, סעיף למטה, ודגירה במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן את נוזלי עודפים מהרשת על ידי הצבת צד סעיף על נייר כדי לסנן ולאחר מכן תצוף על 50 mM גליצין בT / PB במשך 15 דקות בRT. </li></ol> שלב קריטי: כדי למנוע מוגזם &quot;לסחוב על &#39;של פתרונות מאגל פתרון אחד למשנו במהלך incubations, ניקוז נוזל עודף על ידי נגיעה בקצה של הרשת בעדינות על נייר # 1 מסנן בין כל שינוי פתרון. גם להסיר כל פתרון לכוד בין זרועותיו של א&quot;מ מלקחיים מחזיק רשת על ידי פתילה בעדינות עם פיסת נייר מסנן בין זרועות מלקחיים תוך ensuתצלצל הסעיפים לא יתייבשו לחלוטין. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הרשת עם נייר סינון ולאחר מכן צף על חסימת תמיסה המכילה BSA 2.5% ו -2.5% בסרום מהחיה של הנוגדן המשני בT / PB למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני (בT / PB) בRT או O / N ב 4 ° C. הזמן אופטימלי והטמפרטורה של דגירה, כמו גם ריכוז נוגדנים, צריכים להיות נחושים בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הרשת שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) עם T / PB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני (01:20 נגד ארנב או אנטי עכבר מצמיד זהב ננומטר 10) לשעה 1 בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) עם T / PB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Postfix עם glutaraldehyde 2% בT / PB למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) עם T / PB ולאחר מכן שלוש פעמים (2 דקות כל אחד) במים מסוננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 2% יצטט uranyl במים למשך 10 דקות. </li></ol> בעוד הרשת נצבעת, להכין קאמרי CO 2-בחינם על ידי placinחתיכת ga של Parafilm במרכז צלחת פטרי זכוכית. לאחר מכן הנח 4-6 כדורים של NaOH במטבח סביב Parafilm לספוג CO 2 באוויר. שמור העליון נסגר לכמה דקות. השתמש פיפטה פסטר ולהעביר נפח קטן של תמיסת ציטרט להוביל של Reynold לParafilm בצלחת פטרי הזכוכית במהירות. פתח את הראש מספיק כדי להכניס את פיפטה פסטר למזער מחדש המבוא של CO 2 לבית הבליעה. הערה: כדי להפוך את פתרון ציטראט להוביל של Reynold, להרתיח 100 מיליליטר מי deionized במיקרוגל ולתת מגניבים במכל אטום. בבקבוק נפח 50 מ&quot;ל עם פקק, חנק להוביל תמהיל 1.33 גרם, 1.76 ציטראט גרם נתרן ו30 מ&quot;ל של המים רתוחים בניעור נמרץ לדקות 1. ואז ללחוץ לסירוגין למשך 30 דקות. לפתרון עכור זה, להוסיף 8 מ&quot;ל של הידרוקסיד 1 ז נתרן ולהפוך לאט את הבקבוק כמה פעמים. הפתרון יהיה ברור. תביא הפתרון ל50 מ&quot;ל עם wa המבושלter. אחסן את הפתרון האטום בחוזקה. אם מופיע משקע, לבטל ולעשות אחת חדשה. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלוש כוסות קטנות יותר להכין מים חמים, טרי מבושלים deionized. לשטוף תצטט uranyl על ידי טבילת רשת בכוס הראשונה ועדינות מערבלים קצת למשך 30 שניות. חזור על שלב זה בשתי כוסות האחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החלק העליון של צלחת פטרי הזכוכית רק מספיק כדי למקם את הרשת על הירידה של פתרון ציטראט להוביל של Reynold. במידת ההאפשר, ללבוש מסכה כשעושה את זה, כדי למנוע נשימה על ציטראט עופרת ולמנוע היווצרות של משקע. דגירה למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הראש מספיק כדי להסיר את הרשת. הימנע נושם בציטראט העופרת. לשטוף את הרשת שלוש פעמים על ידי טבילתו ברצף בשלוש כוסות עם מים חמים, טרי מבושלים מזוקקים. בואו הרשת יבשה על פיסת נייר סינון, סעיף למעלה. המדגם מוכן כעת למיקרוסקופ האלקטרונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope.">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-+and+affinity+probes+for+electron+microscopy:+a+review+of+labeling+and+preparation+techniques.">Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).</li><li>Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+optimize+post-embedding+single+and+double+staining+for+amino+acid+neurotransmitters.">Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).</li><li>Berryman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tannic+acid+on+antigenicity+and+membrane+contrast+in+ultrastructural+immunocytochemistry.">Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses.">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique:+effects+of+processing+on+probe+distribution.">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li><li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmium-free+method+of+epon+embedment+that+preserves+both+ultrastructure+and+antigenicity+for+post-embedding+immunocytochemistry.">An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> Embo J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li><li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections.">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li><li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+antigen,+one+gold?+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5'-nucleotidase+in+frozen+thin+sections.">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .</li><li>Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Immunologic+analysis+of+families+with+complement+receptor+deficiency].">[Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency].</a> Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).</li><li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces:+a+method+for+precise+quantitation.">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li><li>Bozzola, J. R., Lonnie, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Electron Microscopy. 30, (1992).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses.">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li><li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein:+the+(ACTH)-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism.">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li><li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+phosphoprotein+B-50/GAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity.">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li><li>Maunsbach, A. A., Bjorn, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

בפרוטוקול זה, אנו מאמצים את שיטת Phend ויינברג למוח ורקמות בעמוד שדרה כדי ללמוד קוצים הדנדריטים בתרבויות פרוסות ביפוקמפוס חולדה. קוצים הדנדריטים באזור היפוקמפוס CA3-CA1 הם מבנים עדינים המכילים מגוון עצום של חלבונים שממלאים תפקידים חשובים בויסות תפקודים עצביים. השיטה הוצ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

מיקרוסקופיה Immunoelectron היא כלי רב עצמה כדי לחקור מולקולות ביולוגיות ברמת subcellular. נוגדנים מצמידים את סמני אלקטרונים צפופים כגון זהב colloidal יכולים לחשוף את הלוקליזציה וההפצה של אנטיגנים ספציפיים ברקמות שונות 1. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר הן-הטבעה של לפני או אחרי הטבעת טכניקות. במיקרוסקופיה טכניקות הטבעה מראש immunogold אלקטרונים (EM), הרקמה יש permeabilized כדי לאפשר חדיר נוגדן לפני שהוא משובץ. טכניקות אלה הן אידיאליות לשימור מבנים, אך חדירה נמוכה של הנוגדנים (לעתים קרובות רק כמה מיקרומטרים 1) היא חסרון ניכר 2. שיטות התיוג לאחר ההטבעה יכולות להימנע מבעיה זו, כי התיוג מתרחש בחלקים של רקמות קבועות בי אנטיגנים הם יותר נגישה בקלות. במהלך השנים מספר השינויים שפרו את השיטות שלאחר ההטבעה כדי לשפר immunoreactivity ולשמר ultrastructure <sup&gt; 3-5. קיבעון רקמה הוא חלק חיוני של לימודיהם. Fixatives כימי Crosslink מקרומולקולות לנעול את מבני רקמות במקום. הבחירה מקבעת משפיעה לא רק על שימור מבנים, אלא גם antigenicity וניגוד. tetroxide אוסמיום (אוסו 4), פורמלדהיד, וglutaraldehyde כבר את fixatives הרגיל במשך עשרות שנים, כוללים למערכת עצבים מרכזיות (CNS) רקמות הנוטות במיוחד לניזק מבני במהלך עיבוד כימי ופיזי. למרבה הצער, אוסו 4 הוא מאוד תגובתי והוכח כדי להסוות אנטיגנים 6, וכתוצאה מהתיוג גרוע ובלתי מספק. גישות חלופיות כדי למנוע קיבוע כימי כוללות הקפאת הרקמות. אבל טכניקות אלה הן קשות לביצוע ודורש מכשור יקר. כדי לענות על חלק מהבעיות הללו ולשפר את תיוג רקמות מערכת עצבים מרכזיים, Phend et al. החליף Oso 4 עם תצטט uranyl (UA) וACI טאניד (ת&quot;א), והציג שינויים נוספים בהצלחה כדי לשפר את הרגישות של זיהוי אנטיגן ושימור מבנים במוח וברקמות בעמוד שדרת 7. אנחנו אמצנו שיטת אוסמיום זה ללא לאחר ההטבעה לרקמת מוח חולדה ואופטימיזציה טכניקת התיוג immunogold לזהות וללמוד חלבונים סינפטיים. אנו מציגים כאן שיטה כדי לקבוע את הלוקליזציה של חלבונים סינפטיים ultrastructural בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה. אנו משתמשים בפרוסות תרבית היפוקמפוס organotypic. פרוסות אלה לשמור מעגלי trisynaptic של ההיפוקמפוס, ולכן הם יעילים במיוחד לחקירת פלסטיות הסינפטית, מנגנון מקובל לראות בבסיס למידה וזיכרון. פרוסות ביפוקמפוס Organotypic מיום 5 ו 6 גורים לאחר לידת עכבר / עכברוש יכולות להיות מוכנות כפי שתואר לעיל 8, ושימושיים במיוחד לחריפות מציאה או חלבונים אקסוגניים overexpress. יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה בעבר לפרקaracterize neurogranin (נג), חלבון נוירון ספציפי עם תפקיד קריטי בויסות תפקוד הסינפטי 8,9. יש לנו גם השתמשנו בו כדי לאפיין את הלוקליזציה של ultrastructural calmodulin (רמ&quot;א) וCa 2 + חלבון / CAM תלוי קינאז השני (CaMKII) 10. כפי שמודגם בתוצאות, פרוטוקול זה מאפשר שימור ultrastructural טוב של קוצים הדנדריטים ותיוג יעיל של נג לעזור לאפיין ההפצה שלה בעמוד השדרה של 8. יתר על כן, התהליך המתואר כאן יכול להיות תחולה רחבה בחקר חלבונים רבים אחרים שהיו מעורבים בפונקציות עצביות.

התרשים 2B מראה דוגמה של ההפצה של מולקולות נג אנדוגניים בקוצים הדנדריטים של נוירונים CA1 פירמידליים היפוקמפוס. רשתות עם ניקל (60 ננומטר) המכילות רקמות Ultrathin CA1 אזור של ההיפוקמפוס (כפי שניתן לראות באיור 2 א) היו מכוסות ב1% T / PB, 50 mM גליצין, אז חסמה עם BSA 2.5% ו -2.5%...

Watch this Scientific Journal Video about Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures at JoVE.com

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K Views.  Medical College of Wisconsin. הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמ?...

Video: Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...