Os autores gostariam de agradecer a Matthew Florença para preparação das culturas de hipocampo. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional dos EUA sobre Envelhecimento e Associação de Alzheimer de NZG.

1. Fixação Fixadores são cancerígenas; usar luvas e lidar com os fixadores em uma coifa. Salvo indicação em contrário, todas as incubações são realizadas em gelo e todas as soluções devem ser filtrados antes da utilização. Use microscopia eletrônica de grau de reagentes. Dia 1 <ol><li class="jove_content"> Após condições experimentais (por exemplo, injecção viral, o tratamento medicamentoso), colocar a membrana com organotípicas de fatias do hipocampo de 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri contendo gelada de tampão fosfato 0,1 M (tampão de Sorensen fosfato), pH 7,3. Adicionar 1 - 2 ml de tampão fosfato 0,1 M directamente em cima das fatias para mantê-las frias. </li></ol> Passo crítico: Sempre utilize buffers recém preparados e fixadores. Certifique-se de que o pH do tampão está dentro do intervalo desejado. A incapacidade de fazê-lo pode danificar estruturas celulares. <ol start="2"><li> Para isolar o subcampo CA1 do corte, usar umdescartável bisturi para cortar suavemente através da próxima fatia a DG, em paralelo com a camada de células CA1 (Figura 1). Em seguida, corte a fatia restante verticalmente para remover o subcampo CA3 eo subículo. Cortado um canto da fatia para ajudar a identificar a superfície superior do tecido. </li></ol> NOTA: No caso de nenhum de entrega viral de proteína de interesse é necessária, a fatia de tecido inteiro pode ser fixada após o meio é removido com uma suave lavagem de tampão arrefecido com gelo. Isto é então seguido por corte para fora do CA1. Passo crítico: Acompanhe a parte de cima do tecido para que corte apropriado das grades mais tarde. <ol start="3"><li> Cuidadosamente remover o tecido a partir da membrana usando a parte traseira do bisturi. Usar uma pipeta de Pasteur para transferir cuidadosamente o tecido a uma placa de 12 poços contendo 0,1 M de tampão fosfato. </li><li> Remover o tampão no poço da placa e adicionar 500 &amp; mu, l - 1 ml de fixador gelada (pH 7,3) composta do seguinte: 0,1% de ácido pícrico, paraformaldeído a 1%, e 2,5% de glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M. Incubar durante 2 horas a 4 ° C. </li></ol> NOTA: ácido pícrico pode ser explosivo quando seco. Mantenha-o molhado com água em um recipiente bem fechado. Armazenar em local seco e bem ventilado. <ol start="5"><li> Remova o fixador do poço e lavar as amostras 3 vezes (20 minutos cada) em tampão de fosfato 0,1 M. </li><li> Incubar durante 40 min em 1% de ácido tânico (w / v) em 0,1 M de tampão de maleato, pH 6,0. </li><li> Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. </li><li> Incubar durante 40 min, em acetato de uranilo a 1% (w / v) em tampão de maleato no escuro. Acetato de uranilo é sensível à luz e é radioactivo. Cobrir a proveta com Parafilm ao dissolver-se e armazenar qualquer tampão não utilizado no escuro a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. </li><li> Incubar durante 20 min em 0,5% de cloro platinaide (w / v) em tampão de maleato. </li><li> Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. Armazenar as amostras a 4 ° C até estarem prontos para processamento adicional. </li></ol> 2. Desidratação e incorporação Óxido de propileno é cancerígeno. Evite vapores por trabalhar com ele em uma coifa. Use absoluto, etanol puro a 100%, que não contém qualquer traço de água. Diluir esta etanol absoluto para produzir diferentes concentrações de desidratação. Dia 2 <ol><li> Incubar durante 5 min em etanol a 50% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 70%. </li><li> Incubar durante 15 min, em recém-preparados a 1% de p-fenilenodiamina (PPD) em etanol a 70%. </li><li> Enxaguar três vezes em etanol a 70%. </li><li> Incubar durante 5 min em etanol a 80% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 95%. </li><li> Incubar em etanol 100% duas vezes por 5 minutos de cada. </li><li> Prepare frascos de vidro com tampas de rosca e verifique se eles são limpos e completamente secos. Transferir as fatias de frascos de vidro erotular cada frasco simples e clara. </li><li> Incubar durante 5 min em 1:1 etanol: óxido de propileno. </li><li> Incubar em óxido de propileno a 100% duas vezes por 5 minutos de cada. </li><li> Adicionar resina (Epon) a cada frasco para dar uma mistura 1:1 com o óxido de propileno. Misture delicadamente para 2 horas. Não agite os frascos muito rigor para evitar bolhas que possam interferir com a incorporação. </li><li> Adicionar resina para fazer uma mistura 3:1 de óxido de propileno, e mistura-se durante 2 h. </li><li> Transferir a resina 100% e incubar O / N. </li></ol> Dia 3 <ol start="12"><li> Amostras sanduíche entre as tiras de plástico ACLAR e cura durante 24 horas a 60 ° C. </li></ol> 3. Corte e montagem em Grids Dia 4 <ol><li> Cortar semi-finas (0,5 mm) e as secções coradas com azul de toluidina a 1% + 1% de bórax para determinar a orientação correcta de amostras. </li><li> Corte cortes ultrafinos (60 nm) e montar em grades de níquel, uma seção por grade. </li></ol>4. Imunohistoquímica Todos os amortecedores e água deve ser filtrada antes de usar. Dia 5 <ol><li> Colocar uma gota (~ 50 ul) de tampão de Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, em um pedaço de Parafilm limpo sobre uma superfície plana. Gentilmente pegar a grade com fórceps limpas pela extremidade e flutuar sobre o tampão, a secção abaixo, e incubar durante 10 min à TA. </li><li> Drenar o excesso de líquido a partir da rede, colocando-se na secção do lado de papel de filtro e, em seguida, flutuar na glicina 50 mM em T / PB, durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li></ol> Passo crítico: Para evitar o excesso de &quot;carry-over&quot; de soluções a partir de uma gota de solução para o próximo durante as incubações, drenar o excesso de líquido por tocar suavemente a borda da grade em # 1 filtro de papel entre cada mudança de solução. Também remover qualquer solução de presa entre os braços da pinça EM prende a grade por wicking suavemente com um pedaço de papel de filtro entre os braços de pinça enquanto ensutocar os seções não seque completamente. <ol start="3"><li> Seca-se a grelha com papel de filtro e, em seguida, flutuar na solução de bloqueio contendo BSA a 2,5% e 2,5% de soro a partir do animal de que o anticorpo secundário em T / PB, durante 30 min à TA. </li><li> Incubar com o anticorpo primário (em T / PB), à TA ou O / N a 4 ° C. O tempo óptimo e a temperatura de incubação, assim como a concentração do anticorpo, devem ser determinadas experimentalmente. </li><li> Lava-se a grelha de três vezes (2 minutos cada) com T / PB. </li><li> Incubar com o anticorpo secundário (anti-coelho de 01:20 ou anti-rato acoplado a ouro de 10 nm), durante 1 h à TA. </li><li> Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB. </li><li> Postfix com glutaraldeído a 2% em T / PB, durante 5 min. </li><li> Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB e, em seguida, três vezes (2 minutos cada) com água filtrada. </li><li> Incubar com acetato de uranilo a 2% em água durante 10 min. </li></ol> Enquanto a grade é a coloração, a preparar uma câmara de CO 2-livre por placinga pedaço de Parafilm no centro de uma placa de Petri de vidro. Em seguida, coloca 4-6 pellets de NaOH no prato em torno do Parafilm para absorver CO 2 no ar. Manter a parte superior fechada por alguns minutos. Usar uma pipeta de Pasteur e rápida transferência de um pequeno volume de solução de citrato de chumbo de Reynold para o Parafilm no prato de Petri de vidro. Abrir a parte superior apenas o suficiente para inserir a pipeta de Pasteur para minimizar a re-introdução de CO 2 para a câmara. NOTA: Para fazer a solução de Reynold citrato de chumbo, ferver 100 ml de água deionizada em um forno de microondas e deixe esfriar em um recipiente hermético. Num balão volumétrico de 50 ml com rolha, misturar 1,33 g de nitrato de chumbo, 1,76 g de citrato de sódio e 30 ml de água fervida, mediante agitação vigorosa durante 1 min. Em seguida, agitar intermitentemente por 30 min. A esta solução turva, adicionar 8 ml de hidróxido de sódio 1 M e, lentamente, inverter o frasco algumas vezes. Solução se tornará claro. Levar a solução para 50 ml com o wa fervidater. Guardar a solução hermeticamente fechado. Se parece precipitado, descartar e fazer um novo. <ol start="11"><li> Em três copos menores preparar quente, água recém-fervida deionizada. Lavar o acetato de uranilo, por imersão a grade no primeiro béquer e agitar suavemente-la em torno de 30 seg. Repita este passo nos outros dois copos. </li><li> Abrir a parte superior da placa de Petri de vidro apenas o suficiente para colocar a grelha sobre a gota de solução de citrato de chumbo de Reynold. Se possível, use uma máscara ao fazer isto para evitar respirar em citrato de chumbo e para evitar a formação de precipitado. Incubar durante 10 min. </li><li> Abrir a parte superior apenas o suficiente para remover a rede. Evite respirar no citrato de chumbo. Lave a rede três vezes por imersão sequencialmente em três copos com água morna, recentemente fervida destilada. Deixe que a grade seco sobre um pedaço de papel de filtro, a secção para cima. A amostra está pronta para o microscópio eletrônico. </li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections.">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li><li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+antigen,+one+gold?+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5'-nucleotidase+in+frozen+thin+sections.">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. 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R., Lonnie, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Electron Microscopy. 30, (1992).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses.">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li><li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein:+the+(ACTH)-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism.">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li><li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+phosphoprotein+B-50/GAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity.">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li><li>Maunsbach, A. A., Bjorn, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Neste protocolo, adotamos o método Phend e Weinberg para o cérebro e nos tecidos da medula espinhal para estudar espinhas dendríticas em culturas de ratos hipocampo fatia. Espinhas dendríticas na área CA3-CA1 do hipocampo são delicadas estruturas que contêm uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais. O método apresentado fornece uma abordagem equilibrada para alcançar antigenicidade melhorada, mantendo boa preservação ultraestrutural (F...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

Imunomicroscopia é uma ferramenta poderosa para estudar moléculas biológicas em nível subcelular. Anticorpos acoplados a marcadores densos em electrões, tais como ouro coloidal podem revelar a localização e distribuição de antigénios específicos em diversos tecidos 1. As duas técnicas mais utilizadas são as técnicas de incorporação de pré-e pós-incorporação. Na incorporação de pré-imuno-microscopia eletrônica (ME) técnicas, o tecido deve ser permeabilizadas para permitir a penetração de anticorpos antes de ser incorporado. Estas técnicas são ideais para a preservação de estruturas, mas uma fraca penetração do anticorpo (geralmente apenas os primeiros poucos micrómetros) é um inconveniente considerável 2. Os métodos de pós-incorporação de rotulagem pode evitar este problema, porque rotulagem ocorre em seções de tecidos fixos onde os antígenos são mais facilmente acessíveis. Ao longo dos anos, um número de modificações têm melhorado os métodos de incorporação pós-para aumentar a imunorreactividade e para preservar a ultraestrutura <sup&gt; 3-5. Fixação do tecido é uma parte crucial de estudos EM. Fixadores quimicamente ligações cruzadas das macromoléculas para bloquear as estruturas de tecidos no seu lugar. A escolha de fixador afeta não só a preservação, mas também estrutural antigenicidade e contraste. Tetróxido de ósmio (OsO4), formaldeído, glutaraldeído e têm sido os fixadores padrão ao longo de décadas, incluindo para o sistema nervoso central (SNC), os tecidos que são especialmente propensas a danos estruturais durante processamento químico e físico. Infelizmente, OsO 4 é altamente reactivo e tem sido demonstrado que mascaram os antigénios 6, resultando na rotulagem pobre e insuficiente. Abordagens alternativas para evitar a fixação química incluem o congelamento dos tecidos. Mas estas técnicas são de difícil execução e exigem instrumentação dispendiosa. Para resolver alguns desses problemas e para melhorar a rotulagem SNC tecido, Phend et al. substituído OsO 4 com acetato de uranila (UA) e ACI tânicod (TA), e introduzidos com sucesso modificações adicionais para melhorar a sensibilidade da detecção de antigénio e preservação estrutural em tecidos cerebrais e da medula espinal 7. Adotamos este método ósmio livre de pós-incorporação ao tecido cerebral de ratos e otimizou a técnica de rotulagem immunogold para detectar e estudar proteínas sinápticas. Apresentamos aqui um método para determinar a localização ultra-estrutural de proteínas sinápticas em ratos hipocampais CA1 neurônios piramidais. Utilizamos fatias organotípicas de hipocampo cultivadas. Estas fatias de manter o circuito trisynaptic do hipocampo, e, portanto, são especialmente úteis para o estudo da plasticidade sináptica, um mecanismo muito pensou ser a base de aprendizagem e memória. Organotípicas de fatias de hipocampo pós-natais dias 5 e 6 de ratinho / rato pups pode ser preparado como descrito anteriormente 8, e são especialmente úteis para agudamente knockdown ou superexpressam proteínas exógenas. Nós já usou este protocolo para characterize neurogranin (Ng), uma proteína específica para neurónios, com um papel crítico na regulação da função sináptica 8,9. Temos também utilizado para caracterizar a localização ultraestrutural da calmodulina (CaM), e Ca2 + / CaM proteína-quinase dependente de II (CaMKII) 10. Como ilustrado nos resultados, este protocolo permite a preservação ultraestrutural bom das espinhas dendríticas e rotulagem eficiente de Ng para ajudar a caracterizar a sua distribuição na coluna 8. Além disso, o procedimento aqui descrito pode ter uma ampla aplicabilidade no estudo de muitas outras proteínas envolvidas em funções neuronais.

A Figura 2B mostra um exemplo de distribuição de moléculas endógenas Ng nas espinhas dendríticas de CA1 do hipocampo neurónios piramidais. Grelhas de níquel com ultrafinas (60 nm) contendo tecidos CA1 região do hipocampo (como pode ser visto na Figura 2A) foram cobertos em 1% T / PB, 50 mM de glicina, e depois bloqueadas com BSA a 2,5% e 2,5% de soro, antes da incubação com anti Ng-anticorpo. Após a lavagem com T / PB, grelhas foram então cobertas com anticorpo anti-coelho s...

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido utilizada para preservar as estruturas e os antigénios do SNC para estudar e caracterizar proteínas sinápticas no hipocampo de ratos neurónios CA1 piramidais.

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K visualizações.  Medical College of Wisconsin. A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, ...