我们感谢奥布赖恩在UIC实验室关键的实验评价和讨论。这项工作是由美国心脏协会授予11SDG5230003威乐和国家推进转化科学中心 - UIC批准UL1TR000050临床和转化科学中心。

1。细胞转染<ol><li>板细胞转染前一天，电镀免疫细胞较少。 <ol><li>的免疫：在6孔的板，涂层的玻璃盖玻片（1）用0.02％的明胶在37℃下至少4小时，洗一次的介质，并为每个反应孔，板1×10 5 HEK 293T细胞在2毫升的完整的​​生长培养基[Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中加10％FBS]。 </li><li>对于流式细胞术和Western blot分析：板1.2×10 5 HEK 293T细胞/孔，在2毫升完全培养基的6孔板（0.3×10 5的HEK 293T细胞在0.5ml完全培养基的24孔板中，每孔）。 </li></ol></li><li>准备用于转染的DNA，根据制造商的协议：Effectene（Qiagen公司）用于免疫荧光。中转-LT1（Mirus公司）用于流式细胞仪和Western blot分析。下面列出了所使用的DNA量。 <table border="1"><tbody><tr><tD&gt; </td><td> 24孔培养板（纳克） </td><td> 6孔板（纳克） </td></tr><tr><td> CFP矢量</td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP - LBC </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC的N-PDE4D3-FL（PDE4D3全长） </td><td> 2.5，5，10，20，40，80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3 UCR1（PDE4D3含有UCR1域的N-末端片段） </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3 UCR2 + CAT（PDE4D3 UCR2和催化结构域的C-末端片段） </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table>转用（6）Effectene： <ol><li>添加指示的质粒DNA量+ 4微升增强到100微升缓冲EC，混合，在室温下孵育5分钟。 </li><li>添加5微升Effectene，混合，和孵育10分钟室温。添加逐滴细胞。 </li></ol>转公交LT1（6-well/24-well）： <ol><li>指定量的质粒DNA加入到250μl/50微升的Opti-MEM I的无血清培养基的无菌管中。 </li><li>添加过境-LT1试剂的稀释的DNA混合物和吸管轻轻混合。 （过境LT1试剂：DNA比例是3微升过境LT1试剂的每1微克DNA）。 </li><li>在室温下孵育30分钟，并逐滴加入细胞。 </li></ol></li></ol> 2。流式细胞仪，免疫印迹，免疫细胞制备方法<ol><li>染后24小时，检查前收获细胞荧光落射荧光显微镜下。 </li><li>流式细胞仪分析细胞的准备： <ol><li>用0.5毫升/ 2毫升为24-well/6-well板冰冷的PBS洗涤细胞。 </li><li>使用50μl/250微升0.05％胰蛋白酶分离细胞。 </li><li>用200μl/ 1毫升的DMEM培养基中和胰蛋白酶。 </li><li>合作250微升细胞llect（24孔和6孔板），在500×g离心5分钟，通过离心分离，用Western印迹分析的其它细胞（1毫升）。 </li><li>细胞重悬于250微升FACS缓冲[PBS + 0.5％（W / V）BSA + 2毫米EDTA]，储存在冰流式细胞仪分析。细胞也可以固定在1％多聚甲醛（在PBS中），不会立即生效，如果流式细胞分析。 </li></ol></li><li>平行进行的Western印迹分析的细胞制备方法：用流式细胞仪分析细胞制备方法。 <ol><li>用2ml冰冷的PBS 1X洗涤细胞，裂解细胞，加入100μl的细胞裂解缓冲液[10mM磷酸钠缓冲液，pH值为6.95，150 mM氯化钠，5mM的EDTA，5mM的EGTA，1％的Triton X-100] 。 </li><li>通过离心收集细胞裂解液在4℃下以21,000×g的10分钟</li><li>量化Bradford蛋白检测蛋白浓度，装入等量的每通道蛋白SDS-PAGE，并转​​移到硝酸纤维素免疫。 </li></醇&gt; </li><li>免疫细胞制备。 <ol><li>用2ml PBS冲洗细胞3次，在1毫升的3.7％多聚甲醛（在PBS中）在室温下10分钟固定细胞，然后用2毫升的PBS洗涤3次，持续5分钟。 </li><li>挂载，盖玻片载玻片上，用安装介质。如果需要使用指甲油密封盖玻片边缘。 </li><li>将在4℃检查前的幻灯片。 </li></ol></li></ol> 3。流式细胞仪和免疫荧光显微镜<ol><li>使用的Beckman Coulter公司青色ADP，装有488纳米，405纳米，642纳米的固态激光器的流式细胞术进行。峰会软件用于采集和分析。 <ol><li>校准流式细胞仪使用标准的珠子。 </li><li>剧情前向散射（FSC）/侧向散射（SSC）的线性浇注活细胞人口规模。 </li><li>剧情FSC /电压脉冲宽度选通非聚合活细胞群体。 </li><li>剧情count/FL6（CFP fluorescencE，405 nm）的非聚集现场浇注CFP阳性细胞对数刻度。 </li><li>的的剧情count/FL1（YFP的荧光，488 nm）的对数刻度附设强度。 </li><li>运行YFP-CFP-双阴性样品，调整FSC，SSC，FL1和FL6光电倍增管（PMT）电压来设置每个信号的阈值。 </li><li>跑单阳性（两个YFP +和CFP +）样品未来离线补偿</li><li>获得至少10,000门事件（非聚合现场CFP +细胞）进行分析。 </li></ol></li><li>免疫荧光显微镜使用蔡司​​LSM 510共聚焦显微镜注：重要的是要保持所有的设置（如变焦，针孔探测器的增益，放大器的失调，帧大小，扫描速度快，扫描平均，和激光功率）之间的一致样品进行适当比较的所有数据。 </li></ol> 4。数据分析（使用首脑软件执行） <ol><li>设置分析本收类似协议正确的门控离子： 1号门FSC / SSC点图活细胞。 2号门在FSC /脉冲宽度1号门非聚合活细胞中。 3号门，3号门计数/ CFP非聚合CFP +活细胞。 </li><li>补偿YFP和CFP信号的使用YFP +和CFP +单阳性细胞。 </li><li>重新确定切断线CFP / YFP的阳性细胞。 </li><li>进出口YFP的平均荧光强度（MFI）CFP +细胞到Excel的数据绘制。 </li><li>标准化YFP MFI AKAP - LBC，PDE4D3表达水平，并装载控制α-微管蛋白，Western blot检测。 </li></ol>

<ol>
	<li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+protein-protein+complexes+to+interactomics.">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li><li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li><li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-protein+systems:+beyond+binary+protein-protein+interactions.">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li><li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades.">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li><li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro.">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li><li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation.">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).</li><li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology.">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li><li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry.">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).</li><li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).</li><li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis.">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li><li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li></ol>

作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

附设一个简单而敏感的方法来研究蛋白质相互作用。然而，此方法可以不被使用，以确定新的蛋白质 - 蛋白质相互作用，它是特别方便的，以确认细胞内的蛋白 - 蛋白相互作用和学习功能性质，如细胞内的本地化的蛋白质复合物，蛋白质 - 蛋白质相互作用的网站的映射，并筛查，可以调节蛋白质相互作用的小分子/肽。 ，因为VN和VC片段的非荧光，荧光背景低，从而帮助检测灵敏度。需要时间来成?...

650000蛋白质-蛋白质相互作用，估计存在于人类的相互作用组，发挥着重要的角色，在维持正常的细胞功能1,2。除了 ​​免疫共沉淀（CO-IP）的黄金标准蛋白质相互作用研究从细胞裂解物，一些蛋白质片段互补分析（PCA）已发展到提高灵敏度检测细胞内的蛋白质相互作用3。这些技术包括福斯特共振能量转移（FRET），生物发光共振能量转移（BRET），和双分子荧光互补（附设）4,5。附设是基于荧光蛋白的两个片段（在这里我们使用金星，YFP变种），分别融合到一个潜在的相互作用的蛋白伙伴（在本示例中，我们使用AKAP - LBC和PDE4D3）促进协会。相互作用的两种蛋白质在细胞内的查询结果以功能性荧光的兴趣，它可以是由f可视化luorescence显微镜可以使用活的或固定的细胞6,7,8。相较于其他的PCA，附设敏感的和技术上的挑战，有潜力在活细胞中的细胞定位研究。然而，这种技术的主要缺点是，一旦形成，荧光蛋白复合物不能被逆转。因此，它是不是一个很好的方法来研究动态蛋白质相互作用。在本文中，我们使用附设映射AKAP - LBC PDE4D3的相互作用位点监测的荧光强度金星。相比传统的分析，使用荧光显微镜，这是费时和劳动密集的（如果不进行使用自动化高通过机械），流式细胞术十万个单元格在一个异构的人口提供了一个简单的定量分析，在很短的时间9， 10。在这里，我们开展了流式细胞附设分析和传统的合作IP并排侧比较，表明2米然而，ethods提供可比数据的流式细胞仪附设分析耗时少，并使用更少的材料是有限的感兴趣的细胞时，这可能是更有用的。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2, F1804</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>16B12, MMS-101R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DM1A, T9026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632569</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6-well tissue culture treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep plasmid purification kit, high speed</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S74337MF</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-36931</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 air-jacketed Incubator</td>
			<td>NuAIR DH autoflow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope LSM510 META</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis and transfer unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan ADP Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction

其中的方法来研究细胞内蛋白质相互作用，双分子荧光互补（附设）是相对简单和敏感。附设是根据生产的荧光使用两个非荧光的荧光蛋白的片段（金星，黄色荧光蛋白的变型中，这里使用的是）。非荧光金星片段的（VN和VC）的两个相互作用的蛋白质（在这种情况下，AKAP-LBC和PDE4D3）稠合，得到的荧光由于VN-AKAP-LBC-VC-的PDE4D3相互作用和形成荧光蛋白的功能细胞内。 附设提供的蛋白质复合物的亚细胞定位和蛋白质相互作用的强度，根据荧光强度的信息。但是，附设分析用显微镜量化蛋白 - 蛋白相互作用的强度是耗时且有些主观的，因为蛋白表达的异质性和相互作用。通过耦合流式细胞仪分析与附设的方法，荧光附设的蛋白 - 蛋白相互作用的信号可以精确地测量在短时间内大量的细胞。在这里，我们展示了这种方法的应用程序AKAP-LBC的互动所需要的地区PDE4D3映射。这种高的通过方法可以应用于筛选因子，调节蛋白 - 蛋白相互作用。

AKAP-LBC和PDE4D3的结构（ 图1B）的融合VN和VC片段，分别AKAP - LBC和PDE4D3结果功能YFP的荧光（ 图1A）的相互作用。在这里，我们使用地图AKAP - LBC结合位点PDE4D3附设的方法。 PDE4家族蛋白中上游保守区域1（UCR1），，上游保守区域2（UCR2）和催化区（CAT）是保守的，因此，全长度（FL），UCR1和UCR2加CAT被用于筛选结合部位的PDE4D3 AKAP-LBC。 VN-AKAP-LBC和VC-PDE4D3片段在HEK 293T细胞荧光结?...

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Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

流式细胞仪分析双分子荧光互补提供了一种高通量定量研究蛋白质相互作用的方法。此方法可用于测绘的蛋白结合位点，并用于筛选调节蛋白 - 蛋白相互作用的因素。

双分子荧光互补流式细胞仪分析：高通量的定量方法研究蛋白质 - 蛋白质相互作用

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

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18.3K 次观看.  University of Illinois at Chicago. 流式细胞仪分析双分子荧光互补提供了一种高通量定量研究蛋白质相互作用的方法。此方法可用于测绘的蛋白结合位点，并用于筛选调节蛋白 - 蛋白相互作用的因素。