Agradecemos el laboratorio O&#39;Bryan en la UIC para la evaluación experimental y la discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Beca 11SDG5230003 al Centro GKC y Nacional para el Avance de la Ciencia Traslacional - UIC Centro de Ciencias de la clínica y traslacional Grant UL1TR000050.

1. Transfección celular <ol><li> Células de la placa el día antes de la transfección, plateando el menor número de células de inmunofluorescencia. <ol><li> Por inmunofluorescencia: en una placa de 6 pocillos, escudo cubreobjetos de vidrio (1 por pocillo) con 0,02% de gelatina a 37 ° C durante al menos 4 horas, se lava una vez con medio, y para cada pozo, placa 1 x 10 5 células HEK 293T las células en 2 ml de medio de crecimiento completo [medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más 10% de FBS]. </li><li> Para citometría de flujo y análisis de transferencia Western: placa de 1,2 x 10 5 células HEK 293T / pocillo en 2 ml de medio de crecimiento completo en placa de 6 pocillos (5 x 10 células HEK 293T 0,3 en 0,5 ml de medio de crecimiento completo por pocillo en placas de 24 pocillos ). </li></ol></li><li> Preparar ADN para la transfección de acuerdo con el protocolo de fabricación: Effectene (Qiagen) se utiliza para inmunofluorescencia. TransIT-LT1 (Mirus) se utiliza para citometría de flujo y análisis de transferencia de Western. Cantidad de ADN usada se enumeran a continuación. <table border="1"><tbody><tr><td&gt; </td><td> Placa de 24 pocillos (ng) </td><td> Placa de 6 pocillos (ng) </td></tr><tr><td> CFP-vector </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-Lbc </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (longitud completa PDE4D3) </td><td> 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR1 (un fragmento N-terminal de PDE4D3 que contiene el dominio UCR1) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (un fragmento C-terminal de PDE4D3 que contiene los dominios UCR2 y catalítica) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> La transfección utilizando Effectene (6 pocillos): <ol><li> Añadir cantidad indicada de ADN plásmido + 4 l potenciador a 100 l de tampón CE, la mezcla, y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 5 l Effectene, mezclar e incubar durante 10 minutos atemperatura ambiente. Añadir gota a gota a las células. </li></ol> La transfección con tránsito LT1 (6-well/24-well): <ol><li> Añadir cantidad indicada de ADN plásmido a 250 μl/50 l de Opti-MEM medio libre de suero que en un tubo estéril. </li><li> Añadir TransIT-LT1 reactivos a la mezcla de ADN diluido y pipetear suavemente para mezclar. (Tránsito-LT1 Reactivo: relación DNA es de 3 l de tránsito LT1 reactivo por 1 g de ADN). </li><li> Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y añadir, gota a gota a las células. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de las células para citometría de flujo, Western Blot e inmunofluorescencia <ol><li> 24 h después de la transfección, compruebe fluorescencia al microscopio de epifluorescencia antes de recoger las células. </li><li> Preparación de las células para el análisis de citometría de flujo: <ol><li> Lavar las células con 0,5 ml / 2 ml de PBS enfriado en hielo para las placas 24-well/6-well. </li><li> Separar las células utilizando 50 μl/250 l 0,05% de tripsina. </li><li> Neutralizar la tripsina con 200 l / 1 ml de medio DMEM. </li><li> Collect 250 células l (tanto para la placa de 24 pocillos y 6 pocillos) por centrifugación a 500 xg durante 5 min, se utilizan las células restantes (1 ml) para análisis de transferencia Western. </li><li> Resuspender las células en 250 l de tampón FACS [PBS + 0,5% (w / v) de BSA + 2 mM de EDTA], almacenar en hielo para el análisis de citometría de flujo. Las células también pueden ser fijadas en paraformaldehído al 1% (en PBS) si el análisis de citometría de flujo no será inmediata. </li></ol></li><li> Preparación de las células para el análisis de Western blot: lleva a cabo en paralelo con la preparación de células para el análisis de citometría de flujo. <ol><li> Lavar las células 1 vez con 2 ml de PBS enfriado en hielo, lisar las células mediante la adición de 100 l de tampón de lisis celular [10 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 6,95, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 5 mM EGTA, 1% de Triton X-100] . </li><li> Recoger lisado de células por centrifugación durante 10 min a 21.000 xg a 4 ° C. </li><li> Cuantificar la concentración de proteína mediante el ensayo de proteínas Bradford, cargar la misma cantidad de proteína por carril para SDS-PAGE y transferencia a nitrocelulosa para inmunotransferencia. </li></ol&gt; </li><li> Preparación de las células para inmunofluorescencia. <ol><li> Lavar las células 3 veces con 2 ml de PBS, fijar las células en 1 ml de paraformaldehído al 3,7% (en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente, a continuación, lavar 3 veces con 2 ml de PBS durante 5 min. </li><li> Monte cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio, utilizando medio de montaje. Selle los bordes cubreobjetos utilizando esmalte de uñas si es necesario. </li><li> Guarde las diapositivas a 4 ° C antes del examen. </li></ol></li></ol> 3. Citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia <ol><li> La citometría de flujo se realizó utilizando un Beckman Coulter Cian ADP, equipada con 488 nm, 405 nm, 642 nm y los láseres de estado sólido. Cumbre software se utiliza para la adquisición y análisis. <ol><li> Calibrar citómetro de flujo usando perlas estándar. </li><li> Terreno dispersión frontal (FSC) / Inclinación de lado de dispersión (SSC) en una escala lineal para la población de células vivas de puerta. </li><li> Terreno FSC / tensión ancho de pulso de la población de células vivas no agregada gating. </li><li> Terreno count/FL6 (PPC fluorescence, 405 nm) en una escala logarítmica para las células PPC-positivos en vivo no agregadas de activación periódica. </li><li> Terreno count/FL1 (YFP fluorescencia, 488 nm) en una escala logarítmica de la intensidad BiFC. </li><li> Ejecutar las muestras negativas YFP-PPC-doble, ajuste FSC, SSC, FL1 y FL6 foto tubo multiplicador (PMT) para ajustar la tensión de umbral para cada señal. </li><li> Ejecute un solo positivo (tanto YFP y PPC + +) muestras para futuras compensaciones fuera de línea </li><li> Adquirir al menos 10.000 eventos cerradas (células no agregadas en vivo PPC +) para su análisis. </li></ol></li><li> La inmunofluorescencia se realizó con un LSM 510 microscopio confocal Zeiss Nota:. Es importante tener todas las configuraciones (como el zoom, pinhole, la ganancia del detector, amplificador de desplazamiento, tamaño, velocidad de exploración, exploración de la media, y la potencia del láser) consistente entre muestras para comparación adecuada de todos los datos. </li></ol> 4. Análisis de Datos (realizó utilizando el software Summit) <ol><li> Configurar el protocolo de análisis similar a la de acquisition con la selección adecuada: Puerta 1 en gráfico de puntos de FSC / SSC para las células vivas. Puerta 2 de FSC / ancho de pulso de la puerta 1 para las células vivas no agregados. Puerta 3 en el recuento / PPC de la puerta 3 de la PPC no agregada + células vivas. </li><li> Compensar YFP y PPC señal usando + y PPC + células positivas individuales YFP. </li><li> Vuelva a determinar las líneas de corte para las células CFP / YFP-positivo. </li><li> Export YFP intensidad media de fluorescencia (MFI) de PPC + células a Excel de datos de trazado. </li><li> Normalizar YFP IMF a los niveles de expresión de AKAP-Lbc, PDE4D3, y control de carga α-tubulina, según se determinó por Western blot. </li></ol>

<ol>
	<li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+protein-protein+complexes+to+interactomics.">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li><li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li><li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-protein+systems:+beyond+binary+protein-protein+interactions.">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li><li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades.">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li><li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro.">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li><li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation.">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).</li><li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology.">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li><li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry.">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).</li><li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).</li><li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis.">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li><li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

BiFC es un método simple y sensible para estudiar la interacción proteína-proteína. Este método no se puede utilizar para identificar nuevas interacciones proteína-proteína, sin embargo, es especialmente conveniente para confirmar la interacción proteína-proteína dentro de las células y para estudiar las propiedades funcionales, tales como la localización subcelular de complejos de proteínas, mapeo de sitios de interacción proteína-proteína, y para la detección de pequeñas moléculas / péptidos que pu...

650.000 interacciones proteína-proteína se estima que existen en el interactome humana, jugando un papel crítico en el mantenimiento de las funciones celulares normales 1,2. Además de co-inmunoprecipitación (co-IP), el estándar de oro para el estudio de la interacción proteína-proteína a partir de lisado de células, varios ensayos de complementación de fragmentos de proteínas (PCA) se han desarrollado para mejorar la sensibilidad en la detección de la interacción proteína-proteína dentro de las células 3. Las técnicas incluyen la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) y complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) 4,5. BiFC se basa en la asociación facilitado de dos fragmentos de una proteína fluorescente (aquí usamos Venus; una variante YFP) que están cada uno fusionado a un potencial socio de interacción de proteínas (en este ejemplo utilizamos AKAP-Lbc y PDE4D3). La interacción de las dos proteínas de interés dentro de las células resultados en la fluorescencia funcional, que se pueden visualizar por fmicroscopía luorescence utilizando ya sea células vivas o fijas 6,7,8. En comparación con otros PCAs, BiFC es sensible y técnicamente menos exigente, con potencial para estudiar la localización celular en células vivas. Un inconveniente importante de esta técnica, sin embargo es que una vez formado, el complejo proteína fluorescente puede no ser revertida. Por lo tanto, no es un buen método para estudiar la interacción proteína-proteína dinámico. En este trabajo, utilizamos BiFC para asignar los sitios de interacción de PDE4D3 con AKAP-Lbc controlando la intensidad de fluorescencia de Venus. En comparación con el análisis tradicional utilizando microscopía de fluorescencia, que es mucho tiempo y mano de obra intensiva (si no se lleva a cabo utilizando maquinaria de alto rendimiento automatizado), citometría de flujo proporciona un análisis cuantitativo sencillo de miles de células en una población heterogénea durante un corto período de tiempo 9, 10. Aquí, mediante la realización de una comparación lado a lado de análisis de citometría de flujo-BiFC tradicional y co-IP, se demuestra que las dos métodos de proporcionar información comparable, sin embargo, el flujo de análisis de citometría de BiFC consume menos tiempo y utiliza menos material que puede ser más útil cuando las células de interés son limitados.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2, F1804</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>16B12, MMS-101R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DM1A, T9026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632569</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6-well tissue culture treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep plasmid purification kit, high speed</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S74337MF</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-36931</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 air-jacketed Incubator</td>
			<td>NuAIR DH autoflow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope LSM510 META</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis and transfer unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan ADP Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction

Entre los métodos para el estudio de la interacción proteína-proteína dentro de las células, complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) es relativamente simple y sensible. BiFC se basa en la producción de fluorescencia utilizando dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente (Venus, una variante de la proteína fluorescente amarilla, se utiliza aquí). Fragmentos de Venus no fluorescentes (VN y VC) se fusionan a dos proteínas que interactúan (en este caso, AKAP-Lbc y PDE4D3), produciendo fluorescencia debido a la interacción VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 y la formación de una proteína fluorescente funcional dentro de las células. BiFC proporciona información sobre la localización subcelular de complejos de proteínas y la fuerza de las interacciones de proteínas basado en la intensidad de fluorescencia. Sin embargo, el análisis mediante microscopía BiFC para cuantificar la fuerza de la interacción proteína-proteína es mucho tiempo y es algo subjetivo debido a la heterogeneidad en la expresión de proteínas y la interacción. Por citometría de flujo de acoplamientoanálisis con metodología BiFC, la BiFC señal de la interacción proteína-proteína fluorescente se puede medir con precisión para una gran cantidad de células en un corto período de tiempo. Aquí, demostramos una aplicación de esta metodología para mapear regiones en PDE4D3 que se requieren para la interacción con AKAP-Lbc. Esta metodología de alto rendimiento se puede aplicar a la detección de factores que regulan la interacción proteína-proteína.

AKAP-Lbc y PDE4D3 construcciones (Figura 1B) se fusionaron a VN y fragmentos de VC, respectivamente. Interacción de AKAP-Lbc y PDE4D3 resultados funcionales en YFP fluorescencia (Figura 1A). Aquí se utiliza el método BiFC para asignar sitios AKAP-Lbc vinculantes en PDE4D3. Aguas arriba región conservada 1 (UCR1), región aguas arriba conservada 2 (UCR2) y la región catalítica (CAT) se conservan entre las proteínas de la familia de PDE4, por lo tanto, de longitud completa (FL), UC...

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Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

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JoVE Journal

Biology

18.3K vistas.  University of Illinois at Chicago. Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

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