Agradecemos ao laboratório O&#39;Bryan a UIC para avaliação experimental crítica e discussão. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association Grant 11SDG5230003 ao Centro GKC e Nacional para o avanço da ciência translacional - Centro de UIC para Ciências Clínicas e Translational Grant UL1TR000050.

1. Transfecção celular <ol><li> Células da placa um dia antes da transfecção, chapeamento menos células de imunofluorescência. <ol><li> Para imunofluorescência: em uma placa de 6 poços, casaco lamínulas de vidro (um por poço), com 0,02% de gelatina a 37 ° C durante pelo menos 4 horas, lave uma vez com o meio, e para cada poço, a placa 1 x 10 5 HEK 293T células em 2 ml de meio de crescimento completo [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mais 10% de FBS]. </li><li> Para a citometria de fluxo e análise da mancha Ocidental: placa de 1,2 x 10 5 células HEK 293T / poço em 2 ml de meio de crescimento completo na placa de 6 poços (0,3 x 10 5 células HEK 293T em 0,5 ml de meio de crescimento completo por poço em placas de 24 poços ). </li></ol></li><li> Prepare o ADN para transfecção de acordo com o protocolo do fabricante: Effectene (Qiagen) é utilizado para imunofluorescência. Trânsito LT1 (Mirus) é usado para análises de fluxo de blot e citometria ocidental. Quantidade de ADN utilizada é listado abaixo. <table border="1"><tbody><tr><td&gt; </td><td> Placa de 24 poços (ng) </td><td> Placa de 6 poços (ng) </td></tr><tr><td> PCP-vector </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-Lbc </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) </td><td> 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR1 (PDE4D3 um fragmento N-terminal contém o domínio UCR1) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (fragmento C-terminal contendo os domínios PDE4D3 UCR2 e catalítico) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> A transfecção utilizando Effectene (6 poços): <ol><li> Adicionar quantidade indicada de DNA de plasmídeo + 4 ul potenciador de 100 ul de tampão CE, misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 5 uL Effectene, mistura, e incubar durante 10 min atemperatura ambiente. Adicionar gota a gota, para as células. </li></ol> Transfecção utilizando trânsito-LT1 (6-well/24-well): <ol><li> Adicionar quantidade indicada de DNA de plasmídeo a 250 μl/50 ul de Opti-MEM I meio livre de soro em um tubo estéril. </li><li> Adicionar trânsito LT1-reagente para a mistura de DNA diluído e gentilmente pipeta para misturar. (Transit-LT1 Reagente: relação DNA é de 3 ml de trânsito-LT1 reagente por 1 mg de DNA). </li><li> Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente e adicionar gota a gota, para as células. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de células para citometria de fluxo, Western Blot e Imunofluorescência <ol><li> 24 horas após a transfecção, verifique fluorescência sob microscópio de epifluorescência, antes de células colheita. </li><li> Preparação de células para análise por citometria de fluxo: <ol><li> Lavar as células com 0,5 ml / 2 ml de PBS gelado para placas 24-well/6-well. </li><li> Retire células usando 50 mL μl/250 0,05% de tripsina. </li><li> Neutraliza-se com 200 ul de tripsina / 1 ml de meio DMEM. </li><li> Collect 250 ul de células (tanto para placa de 24 poços e 6 poços) por centrifugação a 500 xg durante 5 min, utilizar as células restantes (1 mL) para análise de Western blot. </li><li> Ressuspender as células em 250 ul de tampão FACS [PBS + 0,5% (w / v) de BSA + 2 mM de EDTA], armazenar em gelo para análise de citometria de fluxo. As células também podem ser fixados em paraformaldeído a 1% (em PBS), se a análise de citometria de fluxo não será imediata. </li></ol></li><li> Preparação de células para análise de Western blot, realizado em paralelo com a preparação de células para análise de citometria de fluxo. <ol><li> Lavar as células com 2 ml de 1x PBS gelado, lise de células por adição de 100 ul de tampão de lise celular [tampão 10 mM de fosfato de sódio, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM de EDTA, 5 mM de EGTA, 1% de Triton X-100] . </li><li> Recolhe ligado celular por centrifugação durante 10 min a 21.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Quantificar a concentração de proteína pelo ensaio de proteína Bradford, coloque a mesma quantidade de proteína por pista para SDS-PAGE, e transferir para nitrocelulose por immunoblotting. </li></ol&gt; </li><li> Preparação de células para imunofluorescência. <ol><li> Lavar as células 3x com 2 ml de PBS, as células fixar em 1 ml de 3,7% de paraformaldeído (em PBS) durante 10 min à temperatura ambiente, em seguida, lavar 3x com 2 ml de PBS durante 5 min. </li><li> Monte cobrir deslizamento em uma lâmina de vidro, utilizando-se de meio de montagem. Selar as bordas lamela usando unha polonês, se necessário. </li><li> Armazenar as lâminas a 4 ° C antes da análise. </li></ol></li></ol> 3. Citometria de fluxo e microscopia de imunofluorescência <ol><li> A citometria de fluxo é realizada utilizando um Beckman Coulter Ciano ADP, equipado com 488 nm, 405 nm, 642 nm e lasers de estado sólido. Software Summit é utilizado para aquisição e análise. <ol><li> Calibrar citômetro de fluxo, utilizando contas padrão. </li><li> Gráfico de dispersão para a frente (FSC) / para o lado de dispersão (SSC) em uma escala linear para gating população de células vivas. </li><li> Plot largura de pulso FSC / tensão para gating população de células vivas não agregada. </li><li> Plot count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) numa escala logarítmica para gating células não agregadas vivos PCP-positivos. </li><li> Plot count/FL1 (YFP fluorescência, 488 nm) em uma escala logarítmica para a intensidade BiFC. </li><li> Executar amostras YFP-CFP-dupla negativa, ajuste FSC, SSC, FL1 e FL6 foto tubo multiplicador (PMT) de tensão para definir o limite para cada sinal. </li><li> Executar único positivo (ambos YFP + e PCP +) amostras para futura compensação off-line </li><li> Adquirir pelo menos 10.000 eventos fechados (células não agregados ao vivo PCP +) para análise. </li></ol></li><li> Microscopia de imunofluorescência é realizada utilizando uma Zeiss LSM 510 microscópio confocal Nota:. Que é importante para manter todas as configurações (como o zoom, pinhole, ganho de detector, amplificador offset, tamanho do quadro, velocidade de digitalização, digitalização média e potência do laser) consistente entre amostras para comparação adequada de todos os dados. </li></ol> 4. Análise de Dados (realizada utilizando Summit Software) <ol><li> Configure o protocolo de análise semelhante à acquisitíon com gating adequada: Gate 1 em FSC / SSC para as células vivas. Gate 2 em FSC / largura de pulso do Portão 1 para as células vivas não agregados. Portão 3 em contagem / CFP do Portão 3 para o PCP não agregada + células vivas. </li><li> Compensar YFP e CFP sinal usando YFP + e + PCP células positivas individuais. </li><li> Re-determinam linhas de corte para as células CFP / YFP-positivos. </li><li> Exportação YFP intensidade média de fluorescência (MFI) de PCP + células para o Excel para dados de plotagem. </li><li> Normalizar YFP a níveis de IFM-AKAP Lbc, PDE4D3 expressão, e carregamento de controlo α-tubulina, tal como determinado por Western blot. </li></ol>

<ol>
	<li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+protein-protein+complexes+to+interactomics.">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li><li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li><li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-protein+systems:+beyond+binary+protein-protein+interactions.">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li><li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades.">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li><li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro.">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li><li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation.">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).</li><li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology.">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li><li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry.">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).</li><li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).</li><li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis.">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li><li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

BiFC é um método simples e sensível para estudar a interacção proteína-proteína. Este método não pode ser utilizado para identificar novas interacções proteína-proteína, no entanto, é especialmente conveniente para confirmar a interacção proteína-proteína no interior das células e para estudar as propriedades funcionais, tais como a localização subcelular de complexos de proteínas, mapeamento de sítios de interacção proteína-proteína, e para o rastreio de péptidos / moléculas pequenas que po...

650.000 de interacções proteína-proteína são estimadas a existir no interactoma humano, desempenham papéis críticos para manter as funções normais da célula 1,2. Além de co-imunoprecipitação (co-PI), o padrão de ouro para estudar a interacção proteína-proteína a partir de lisados ​​de células, vários ensaios de complementação fragmento de proteína (APC) foram desenvolvidos para melhorar a sensibilidade na detecção de interacção proteína-proteína no interior das células 3. As técnicas incluem a transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), bioluminescência Resonance Energy Transfer (BRET) e Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC) 4,5. BiFC é baseada na associação facilitada de dois fragmentos de uma proteína fluorescente (aqui usamos Vénus; uma variante YFP) que são, cada um fundido com um parceiro de proteína interagindo potencial (neste exemplo utilizamos AKAP-Lbc e PDE4D3). A interacção das duas proteínas de interesse dentro de células resulta em fluorescência funcional, que podem ser visualizadas por fmicroscopia luorescence usando tanto células vivas ou fixo 6,7,8. Comparado a outros PCAs, BiFC é sensível e menos tecnicamente desafiador, com potencial para estudar a localização celular em células vivas. Um grande inconveniente desta técnica é que, no entanto, uma vez formado, o complexo de proteína fluorescente não pode ser revertida. Portanto, não é um bom método para estudar a interacção proteína-proteína dinâmico. Neste trabalho, usamos BiFC para mapear os sítios de interação de PDE4D3 com AKAP-Lbc, monitorando as intensidades de fluorescência de Vênus. Em comparação com a análise tradicional utilizando a microscopia de fluorescência, o que é demorado e trabalhoso (se não for realizado utilizando maquinaria de alta taxa de transferência automatizada), citometria de fluxo, fornece uma análise quantitativa e simples dos milhares de células numa população heterogénea durante um curto período de tempo 9, 10. Aqui, através da realização de uma comparação lado-a-lado da análise de citometria de fluxo-BiFC tradicional e co-PI, que demonstram que os dois métodos proporcionam dados comparáveis, no entanto, a análise de fluxo citométrico BiFC é menos demorado e utiliza menos material, que pode ser mais útil quando as células de interesse são limitadas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2, F1804</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>16B12, MMS-101R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DM1A, T9026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632569</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6-well tissue culture treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep plasmid purification kit, high speed</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S74337MF</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-36931</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 air-jacketed Incubator</td>
			<td>NuAIR DH autoflow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope LSM510 META</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis and transfer unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan ADP Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction

Entre os métodos para estudar a interação proteína-proteína dentro das células, Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC) é relativamente simples e sensível. BiFC baseia-se na produção de fluorescência utilizando-se dois fragmentos não fluorescentes de uma proteína fluorescente (Vénus, uma variante de proteína fluorescente amarela, é aqui utilizada). Fragmentos de Vénus não fluorescente (VN e VC) são fundidos a duas proteínas que interagem (neste caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), produzindo fluorescência devido à interacção VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e a formação de uma proteína fluorescente funcional no interior das células. BiFC fornece informações sobre a localização subcelular de complexos de proteínas e a intensidade das interacções de proteínas com base na intensidade de fluorescência. No entanto, a análise por microscopia de BiFC para quantificar a força da interacção proteína-proteína é demorado e subjectivos, devido à heterogeneidade na expressão da proteína e interacção. Acoplando citometria de fluxoA análise com a metodologia BiFC, o sinal BiFC interacção proteína-proteína fluorescente pode ser medida com precisão para uma grande quantidade de células num curto espaço de tempo. Aqui, nós demonstramos uma aplicação desta metodologia para mapear regiões PDE4D3 que são necessárias para a interação com AKAP-Lbc. Esta metodologia de elevado rendimento pode ser aplicado a factores de rastreio que regulam a interacção proteína-proteína.

AKAP-Lbc e PDE4D3 construções (Figura 1B) foram fundidas com fragmentos de VN e VC, respectivamente. Interacção dos AKAP-Lbc e PDE4D3 funcional resulta em YFP fluorescência (Figura 1A). Aqui usamos o método BiFC para mapear locais AKAP-LBC-vinculativos PDE4D3. Upstream uma região conservada (UCR1), a região a montante conservada 2 (UCR2) e região catalítica (CAT) são conservados entre as proteínas da família da PDE4, por conseguinte, o comprimento total (FL), e UCR1 UCR2 ma...

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Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

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Biology

18.3K visualizações.  University of Illinois at Chicago. Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

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