肺肿瘤细胞招募分析

该方法有助于回答肿瘤生物学领域有关转移分子机制的关键问题。这种技术的主要优点是，在远程器官内招募肿瘤细胞可以定量。首先使用非酶细胞分离试剂，根据标准协议从培养容器中去除荧光蛋白表达刘易斯肺癌（LLC）的细胞。

离心前将产生的细胞溶液转移到15毫升锥形管中，每次洗涤时，离心机将颗粒洗涤两次，以5毫升PBS为单位。第二次洗涤后，通过40微米孔细胞过滤器过滤细胞，将悬浮液稀释至每毫升浓度10至6个细胞的1倍。然后将细胞装入装有29规格针头的一毫升注射器，将100微升细胞注入每只8至10周大的C57-Black-6雄性小鼠的尾静脉。

在适当的实验终点点，使用剪刀从每只小鼠的腹腔表面去除皮肤，并切开肋骨和隔膜以露出胸腔。使用 25 量的有翼输液针和管子通过右心室冲洗 15 毫升 PBS，并取出心脏和胸腺。用钳子抓住气管，拉起来，解剖气管周围的结缔组织，收获肺部。

然后在PBS中清洗肺部，并在荧光显微镜下分离一个叶，以原位可视化荧光细胞。要消化肺组织，首先用剪刀切碎果叶，然后将肺片放在10毫升注射器中。用柱塞关闭注射器，将五毫升消化液吸入注射器，将柱塞从注射器轴中移动，直到肺组织在整个溶液中传播。

将肺浆放入50毫升管中，在37摄氏度和150转/小时内将组织消化在相互摇床上15分钟。在孵育结束时，将剩余的组织三联，直到肺细胞完全分散，然后将管子返回摇床30分钟。然后通过40微米孔隙过滤器过滤细胞，并通过离心收集细胞。

要通过流式细胞分析分离的肺细胞，将颗粒重新在两毫升红细胞解液缓冲液中，在室温下一分钟，通过离心收集细胞。然后将颗粒在五毫升新鲜PBS中离心两次，每次洗涤辅以1%牛血清白蛋白。第二次离心后，将颗粒重新塞在一毫升新鲜PBS加BSA中，并通过新的40微米孔隙过滤器过滤细胞，通过流动细胞分量。

肺部在注射两小时后出现许多GP-LLC细胞，绝大多数细胞在24小时内从肺部消失。请注意，在红色过滤器内检测到的任何荧光斑都应从细胞计数中排除。为了确认肺部的GP-LLC数量，其中一个叶可用于流动细胞测量分析，如所证明的。

在尝试此程序时，重要的是要记住，冷冻节程序是观察肿瘤细胞确切位置的更准确方法。