Bu yöntem, tümör biyolojisi alanında metastazın moleküler mekanizmaları ile ilgili anahtar soruların cevaplatını yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, uzak bir organ içinde tümör hücrelerinin işe quantitate olabilir. Floresan protein ifade Lewis akciğer karsinomu kaldırmak için bir enzimatik olmayan hücre dissosiasyon reaktifi kullanarak başlayın, veya LLC, standart protokollere göre kendi kültür konteyner hücreleri.
Ortaya çıkan hücre çözeltisini santrifüjden önce 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüj peletleri yıkama başına beş mililitre PBS'de iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra hücreleri 40 mikrometrelik gözenek hücresi süzgecinden geçirin ve süspansiyonu mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye kadar bir kez 10'a kadar seyreltin. Sonra hücreleri 29 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir mililitrelik şırıngaya yükleyin ve her sekiz ila 10 haftalık C57-Black-6 erkek farenin kuyruk damarına 100 mikrolitre hücre enjekte edin.
Uygun deneysel uç noktada, her farenin ventral yüzeyinden deri kaldırmak için makas kullanın ve göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için kaburga ve diyafram kesti. Sağ ventrikül aracılığıyla PBS 15 mililitre floş ve kalp ve timus kaldırmak için 25-gauge kanatlı infüzyon iğne ve tüp kullanın. Nefes borusunu forceplarla tutarak, yukarı çekin, trakeanın etrafındaki bağ dokularını parçalayarak akciğerleri hasat edin.
Sonra PBS akciğerleri yıkayın, ve floresan mikroskop altında yerinde floresan hücrelerin görselleştirilmesi için bir lob ayırmak. Akciğer dokusunu sindirmek için, önce makasla kaudal loba zar atve akciğer parçalarını 10 mililitrelik şırıngaya yerleştirin. Şırıngayı pistonla kapatın ve beş mililitre sindirim çözeltisini şırınganın içine aspire edin, akciğer dokusu çözelti boyunca yayılana kadar şırınga şaftına girip çıkar.
Akciğer bulamacını 50 mililitrelik bir tüpe dağıtın ve 37 santigrat derece ve 150 rpm'de 15 dakika boyunca karşılıklı bir çalkalayıcıda dokuyu sindirin. Kuluçka sonunda, akciğer hücreleri tamamen dağılına kadar kalan doku triturate, ve ek bir 30 dakika için shaker tüp dönmek. Daha sonra hücreleri 40 mikrometrelik gözenek süzgecinden geçirin ve santrifüj ile hücreleri toplayın.
Akış sitometri ile izole akciğer hücrelerini analiz etmek için, oda sıcaklığında bir dakika için kırmızı kan hücre lisis tampon iki mililitre pelet resuspend, ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Sonra taze PBS beş mililitre pelet iki kez santrifüj yıkama başına% 1 sığır serum albumin ile takviye. İkinci santrifüjden sonra, taze PBS artı BSA bir mililitre pelet resuspend, ve akış sitometri ile tümör hücrelerinin sayısallaştırılması için yeni bir 40 mikrometre gözenek süzgeci ile hücreleri filtre.
Akciğerler enjeksiyondan iki saat sonra birçok GFP-LLC hücresi sunar, hücrelerin büyük çoğunluğu 24 saat içinde akciğerlerden kaybolur. Kırmızı filtre içinde algılanan floresan lekelerin hücre sayısından çıkarılması gerektiğini unutmayın. Akciğerlerdeki GFP-LLC sayısını doğrulamak için loblardan biri gösterildiği gibi akış sitometrik analizi için kullanılabilir.
Bu prosedürü çalışırken, dondurulmuş bir kesit prosedürü tümör hücrelerinin tam yerini gözlemlemek için daha doğru bir yöntem olduğunu hatırlamak önemlidir.
