폐 종양 세포 모집 분석 결과

이 방법은 전이의 분자 기계장치에 관하여 종양 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 원격 기관 내의 종양 세포의 모집이 수량일 수 있다는 것입니다. 표준 프로토콜에 따라 배양 용기에서 형광 단백질 발현 루이스 폐 암종 또는 LLC세포를 제거하기 위해 비 효소 세포 해리 시약을 사용하여 시작합니다.

결과 세포 용액을 원심분리 전에 15밀리리터 원원형 튜브로 옮기고, 원심분리기는 세척당 PBS의 5밀리리터에서 펠릿을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 40 마이크로미터 모공 세포 스트레이너를 통해 세포를 필터링하고, 현탁액을 밀리리터 농도당 6세포로 10배로 희석한다. 그런 다음 29 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 주사기에 세포를로드하고 8- 10 주 된 C57-Black-6, 수컷 마우스의 꼬리 정맥에 100 마이크로 리터의 셀을 주입하십시오.

적절한 실험 적 끝점에서 가위를 사용하여 각 마우스의 복부 표면에서 피부를 제거하고 갈비뼈와 횡격막을 잘라 흉부 구멍을 노출시하십시오. 25 게이지 날개 주입 바늘과 튜브를 사용하여 오른쪽 심실을 통해 PBS의 15 밀리리터를 플러시하고 심장과 흉통을 제거하십시오. 집게로 기관을 잡고, 당겨, 기관 주위의 결합 조직을 해부, 폐를 수확.

그런 다음 PBS에서 폐를 세척하고 형광 현미경으로 시상에서 형광 세포의 시각화를 위해 하나의 엽을 분리합니다. 폐 조직을 소화하기 위해, 먼저 가위로 caudal 엽을 주사위, 10 밀리리터 주사기에 폐 조각을 배치. 플런저로 주사기를 닫고 소화용액 5밀리리터를 주사기에 흡인시키고, 플런저를 주사기 샤프트 안팎으로 이동하여 폐 조직이 용액 전체에 보급될 때까지 주사기 샤프트 안팎으로 이동합니다.

폐 슬러리를 50 밀리리터 튜브에 분배하고, 섭씨 37도와 150rpm에서 15분 동안 상호 셰이커에 티슈를 소화합니다. 인큐베이션의 끝에서, 폐 세포가 완전히 분산 될 때까지 나머지 조직을 삼각하고, 추가 30 분 동안 셰이커에 튜브를 반환합니다. 그런 다음 40 마이크로미터 모공 스트레이너를 통해 세포를 필터링하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.

혈중 세포측정에 의해 고립된 폐 세포를 분석하기 위해, 실온에서 1분 동안 적혈구 용해 완충제 의 2밀리리터에서 펠릿을 재보중단하고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 그런 다음 신선한 PBS의 5 밀리리터에서 펠릿을 두 번 원심 분리하여 세척당 1 %소 세럼 알부민으로 보충합니다. 두 번째 원심 분리 후, 신선한 PBS 플러스 BSA의 1 밀리리터에서 펠릿을 재연하고, 혈동 세포에 의해 종양 세포의 정량화를 위한 새로운 40 마이크로미터 모공 스트레이너를 통해 세포를 필터링한다.

폐는 주입 후에 2 시간 많은 GFP-LLC 세포를 제출합니다, 세포의 대다수는 24 시간 안에 폐에서 사라지고 있습니다. 빨간색 필터 내에서 감지되는 형광 반점은 셀 수에서 제외되어야 합니다. 폐내GFP-LLC의 수를 확인하기 위해, 로브 중 하나는 입증된 바와 같이 유동 세포 측정 분석에 사용될 수 있다.

이 절차를 시도하는 동안, 냉동 단면 절차는 종양 세포의 정확한 위치를 관찰하기위한 보다 정확한 방법입니다 기억하는 것이 중요합니다.