Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie tumorale sur les mécanismes moléculaires de la métastase. Le principal avantage de cette technique est que le recrutement de cellules tumorales dans un organe éloigné peut être quantitate. Commencez par utiliser un réaccien de dissociation cellulaire non enzymatique pour enlever le carcinome pulmonaire de Lewis exprimant des protéines fluorescentes, ou LLC, cellules de leur récipient de culture selon les protocoles standard.
Transférer la solution cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres avant la centrifugation, et la centrifugeuse laver les granulés deux fois en cinq millilitres de PBS par lavage. Après le deuxième lavage, filtrer les cellules à travers une passoire à cellules poreuses de 40 micromètres, et diluer la suspension à une fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre. Chargez ensuite les cellules dans une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 29 et injectez 100 microlitres de cellules dans la veine arrière de chaque souris mâle de huit à dix semaines, C57-Black-6.
Au point de terminaison expérimental approprié, utilisez des ciseaux pour enlever la peau de la surface ventrale de chaque souris, et coupez les côtes et le diaphragme pour exposer la cavité thoracique. Utilisez une aiguille d’infusion ailé de calibre 25 et un tube pour rincer 15 millilitres de PBS à travers le ventricule droit, et enlever le cœur et le thymus. Saisir la trachée avec des forceps, tirer vers le haut, disséquer les tissus conjonctifs autour de la trachée, pour récolter les poumons.
Ensuite, lavez les poumons dans PBS, et détachez un lobe pour la visualisation des cellules fluorescentes in situ sous un microscope à fluorescence. Pour digérer le tissu pulmonaire, dés d’abord le lobe caudal avec des ciseaux, et placer les morceaux de poumon dans une seringue de 10 millilitres. Fermez la seringue avec le piston et aspirez cinq millilitres de solution de digestion dans la seringue, déplaçant le piston dans et hors de l’arbre de seringue jusqu’à ce que le tissu pulmonaire soit disséminé dans toute la solution.
Distribuez le lisier pulmonaire dans un tube de 50 millilitres et digéz le tissu sur un shaker réciproque pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 150 rpm. À la fin de l’incubation, triturer le tissu restant jusqu’à ce que les cellules pulmonaires soient complètement dispersées et remettre le tube au shaker pendant 30 minutes supplémentaires. Filtrez ensuite les cellules à travers une passoire poreuse de 40 micromètres et recueillez les cellules par centrifugation.
Pour analyser les cellules pulmonaires isolées par cytométrie d’écoulement, résuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge pendant une minute à température ambiante, et recueillez les cellules par centrifugation. Puis centrifugez la pastille deux fois en cinq millilitres de PBS frais complétés par 1% d’albumine de sérum bovine par lavage. Après la deuxième centrifugation, resuspendez la pastille en un millilitre de PBS frais plus BSA, et filtrez les cellules à travers une nouvelle passoire pore de 40 micromètres pour la quantification des cellules tumorales par cytométrie d’écoulement.
Les poumons présentent de nombreuses cellules GFP-LLC deux heures après l’injection, la grande majorité des cellules disparaissant des poumons dans les 24 heures. Notez que les taches fluorescentes détectées dans le filtre rouge doivent être exclues du nombre de cellules. Pour confirmer le nombre de GFP-LLC dans les poumons, l’un des lobes peut être utilisé pour l’analyse cytométrique de flux comme démontré.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’une procédure de section congelée est une méthode plus précise pour observer l’emplacement exact des cellules tumorales.
