光刺激后小龙虾光受体的脱敏和回收

该程序的总体目标是研究小龙虾光感受器的脱敏和灵敏度恢复作为昼夜的一个函数，利用隔离眼库中光感受细胞的细胞间电记录，采用不连续的单电极开关电压夹紧配置。这种方法可以帮助回答神经生物学领域的关键问题，如光受体在灭活和恢复中许多电生理特性的昼夜时间依赖性。该技术的主要优点是，它允许测量光感受器的电活动。

尽管难以分离细胞，不干扰细胞内环境。证明这个程序将是医生卡罗来纳·巴里加-蒙托亚和阿拉塞利德拉奥马里特内斯，我们实验室的同事。要准备细胞内电极，请用微管拉拔器拉取玻璃毛细管，以获得带小开口的薄尖端。

接下来，用毛细管填充拉毛细管玻璃，用2.7摩尔氯化钾溶液填充，然后用细注射针填充一半的移液器。如有必要，点按电极移液器以消除气泡。之后，将电极放在支架上。

使用放大器将支架连接到放大器头级。之后，使用稳定的 3-D 微操纵器定位电极支架头级。降低电极，直到沐浴溶液盖住其尖端。

选择放大器的桥模并测量电极电阻。确保电阻约为 50 兆欧姆。使用放大器部分电压夹中的保持位置按钮和放大器微电位 1 部分中的电容中和按钮，将偏移电流静音并补偿电容瞬变。

要构建超级熔合系统，请将浴液倒入合适的容器中，并连接到灌溉管组，从而连接记录室。使用重力驱动的超级输液系统。将流速调节到 0.5 毫升/秒。

将腔室连接到吸气装置。使用真空泵调节溶液吸附系统，使记录室的总量不改变。要分离成年小龙虾的眼存量，请用一把细剪刀将其从底座上分离。

用剃刀刀片在后角膜中打开一平方毫米，以进入视网膜。接下来，将眼部放在录音室的中心，视网膜朝上。在黑暗中保持眼睛存量20分钟。

将微电杆平行于眼部垂直轴，使微电杆居中以进入视网膜。使用立体显微镜将设备置于正确的配置中。接下来，通过选择放大器的桥接模式，监控参考电极和记录电极之间的电压差。

将电极放入浴缸中，并放在视网膜上。取下显微镜，将光刺激灯与眼部垂直轴平行放置。然后，慢慢降低微电机，直到检测到突然的电压下降。

随后，提供测试光闪光，记录光感受器的受体电位。为了获得光引出电流的适当记录，对健康的光感受细胞进行良好的损伤至关重要。在此过程中，通过在数据采集软件中选择保持振幅，将电池的静膜电位固定电压。

然后，选择放大器的 DSEVC 模式。在放大器的模式部分，选择 SEVC 按钮，然后将操纵杆切换到 Discont。SEVC 位置。

将开关速率设置为 500 至 1，000 赫兹，由电极速度决定。之后，传递一个光闪光并观察唤起的离子通量。然后，传递一对光脉冲，并在所需的时间间隔后应用第二个闪光。

使用数据采集软件以 10 千赫采样率对电流进行数字化，并保存数据以供离线分析。此处显示的是双脉冲协议。光刺激在零毫秒和700毫秒时应用。

此图显示了从脱敏状态的恢复。这里是延迟恢复，这里是峰值电流恢复，这里是脱敏时间恒定tau恢复。实验在昼夜零时进行。

此图显示了从脱敏作为昼夜时间函数的恢复。这是 iP 恢复，这是 L 恢复，这是 tau 恢复，此图显示加权时间常量。双相进程用箭头标记。

一旦掌握，这项技术可以在两个小时内完成，如果它做正确。在尝试此过程时，重要的是要记住实现低噪声和低泄漏电流、光感受器损伤。遵循这个程序，其他方法，如药理学分析，可以做，以回答其他问题，如参与特定的通道，受体，或信号通路。

该技术开发后，为神经生物学领域的研究人员探索光受体细胞电生理特性的昼夜时间依赖性铺平了道路。看完这段视频后，您应该对如何使用细胞内记录技术研究光激活转导电流的脱敏和恢复有了很好的了解。