この手順の全体的な目的は、円錐時間の関数としてのザリガニの感作および感受性回復を研究し、単離された眼ストックにおける感光体細胞の細胞間電気的記録を用いて、不連続な単一電極スイッチ電圧クランプ構成を採用することである。この方法は、神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます, 不活性化と回復における光受容体の非常に多くの電気生理学的特性の概日時間依存性など.この技術の主な利点は、光受容体の電気的活性の測定を可能にすることである。
細胞を単離するのが困難であるにもかかわらず、細胞内ミリューを妨げない。この手順を実証するのは、医師カロライナ・バリガ・モントーヤとアラセリ・デ・ラ・マリトネス、私たちの研究室の同僚になります。細胞内電極を準備するために、ガラスキャピラリーチューブをマイクロピペットプーラーで引っ張り、小さな開口部を有する薄い先端を得る。
次に、引っ張られた毛細管ガラスに毛細血管で2.7モルの塩化カリウム溶液を充填し、次にピペットの半分を細かい注射針で満たします。必要に応じて、電極ピペットをタップして気泡を除去します。その後、電極をホルダーに置きます。
アンプのヘッドステージにホルダーをアンプで接続します。その後、安定した3Dマイクロマニピュレータで電極ホルダーヘッドステージを配置します。槽溶液が先端を覆うまで電極を下げます。
アンプのブリッジモードを選択し、電極抵抗を測定します。抵抗が約50メガオームであることを確認してください。アンプのセクション電圧クランプの保持位置ボタンと、アンプのマイクロ電極1セクションの静電容量中和ボタンを使用してオフセット電流を無効にし、容量性トランジェントを補償する。
スーパーフュージョンシステムを構築するには、適切なレセプタクルに浴液を注ぎ、洗浄チューブセットに接続し、記録室を接続します。重力駆動のスーパーフュージョンシステムを使用します。流量を毎秒0.5ミリリットルに調整します。
チャンバーを吸引装置に接続します。記録室の総容積が変化しないように真空ポンプで溶液吸引システムを調節する。成虫ザリガニの目のストックを分離するには、細かいはさみでベースから取り外します。
片方の刃を使用して、片方の角膜に1平方ミリメートルの開口部を作り、残膜にアクセスします。次に、目のストックを、レティナを上に向けて開口部を持つ記録室の中央に置きます。20分間暗闇の中で目のストックを保ちます。
微小電極を眼ストックの縦軸に平行に配置し、マイクロ電極が中心に位置し、その点を経て、その後の眼にアクセスするようにします。立体顕微鏡を使用して、デバイスを正しい構成に配置します。次に、アンプのブリッジモードを選択して、参照電極と記録電極の電圧差を監視します。
電極を槽に下げ、レティナのすぐ上に置きます。顕微鏡を取り外し、眼の縦軸に平行な光刺激ランプを配置します。次に、急激な電圧降下が検出されるまで、マイクロ電極をゆっくりと下げる。
続いて、光受容体の可能性を記録するテスト光フラッシュを提供する。光を引き出す電流の適切な記録を得るためには、健康な感光体細胞の良好な障害を作ることが重要です。この手順では、データ取得ソフトウェアで保持振幅を選択して、測定された静止膜電位で電圧をクランプします。
次に、アンプのDSEVCモードを選択します。アンプのモードセクションで、SEVCボタンを選択し、レバーをDiscontに切り替えます。SEVC 位置。
電極の速度によって決まる500~1,000ヘルツに切り替え速度を設定します。その後、軽いフラッシュを送り、呼び起こされるイオンフラックスを観察します。次に、一対の光パルスを送り、希望の時間間隔の後に2番目のフラッシュを適用します。
データ取得ソフトウェアを使用して電流を10キロヘルツサンプリングでデジタル化し、オフライン分析のためにデータを保存します。ここに示されているのは、2パルスプロトコルです。光刺激は0ミリ秒と700ミリ秒で適用された。
この図は、脱感作からの回復を示す。ここでは、遅延回復であり、ここではピーク電流回復であり、ここでは、脱感作時一定タウ回復です。実験は、概日時間ゼロ時間で行った。
この図は、概日時間の関数としての脱感作からの回復を示す。これはiP回復であり、これはL回復であり、これはタウ回復であり、このグラフは加重された時間定数を示す。2-32 のプロセスは矢印でマークされます。
一度習得したら、このテクニックは、それが正しく行われている場合、2時間で行うことができます。この手順を試みる間、低ノイズと低漏れ電流、感光体障害を目指すことを忘れないでください。この手順に従って、薬理学的アッセイのような他の方法は、特定のチャネル、受容体、またはシグナル伝達経路の関与のような追加の質問に答えるために行うことができる。
その開発後、この技術は、神経生物学の分野の研究者が感光体細胞の電気生理学的特性の概日時間依存性を探求する道を開いた。このビデオを見た後、細胞内記録技術を用いて、光活性化伝達電流の脱感作と回復を研究する方法をよく理解する必要があります。
