Bu işlemin genel amacı, izole göz stoklarında fotoreseptör hücrelerinin hücreler arası elektrik kayıtlarını kullanarak, sürekli tek elektrot anahtarlı voltaj kelepçesi konfigürasyonunu kullanarak, kerevit fotoreseptörlerinin sirkadiyen zamanın bir fonksiyonu olarak duyarsızlaştırma ve duyarlılık geri kazanımını incelemektir. Bu yöntem nörobiyoloji alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, inaktivasyon ve kurtarma fotoreseptörlerin birçok elektro-fizyolojik özellikleri sirkadiyen zaman bağımlılığı gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, fotoreseptörlerin elektriksel aktivitesinin ölçülmesine olanak sağlamasıdır.
Hücreleri izole etme zorluğuna rağmen ve hücre içi ortamı bozmadan. Bu prosedürü gösteren Doktorlar Carolina Barriga-Montoya ve Araceli de la O-Maritnez, bizim laboratuvar iş arkadaşları olacaktır. Hücre içi elektrodu hazırlamak için, küçük bir açıklık ile ince bir ipucu elde etmek için bir mikropipet puller ile cam kılcal tüp çekin.
Daha sonra, kapiller tarafından 2.7-molar potasyum klorür çözeltisi ile çekilen kapiller cam doldurun ve daha sonra, ince bir enjeksiyon iğnesi ile pipet yarısını doldurun. Gerekirse, hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için elektrot pipet dokunun. Bundan sonra, elektrot tutucusu üzerine yerleştirin.
Tutucuyu amplifikatör baş aşamasına amplifikatörle bağlayın. Bundan sonra, elektrot tutucu baş sahne kararlı bir 3-B mikromanipülatör ile konumlandırın. Banyo çözeltisi ucunu kaplayana kadar elektrot aşağı.
Amplifikatörün köprü modunu seçin ve elektrot direncini ölçün. Direnç yaklaşık 50 megaohms olduğundan emin olun. Amplifikatörün kesit gerilim kıskacındaki tutma pozisyonu düğmesini ve amplifikatörün Microelectrot 1 bölümündeki kapasitans nötralizasyon düğmesini kullanarak ofset akımını etkisiz hale getirin ve kapasitif geçici leri telafi edin.
Süper füzyon sistemi oluşturmak için, uygun bir hazne içine banyo çözeltisi dökün ve bir sulama boru setine bağlamak, böylece kayıt odası bağlayarak. Yerçekimine dayalı bir süper füzyon sistemi kullanın. Akış hızını saniyede 0,5 mililitre olarak düzenleyin.
Hazneyi bir emme cihazına bağlayın. Çözelti emme sistemini bir vakum pompası ile kayıt odasının toplam hacminin değişmeyecek şekilde düzenleyin. Yetişkin bir kerevitin göz stoğunu izole etmek için, onu bir çift ince makasla tabanından ayırın.
Retinaerişmek için bir jilet kullanarak sırt korneasında bir milimetre kare bir açılış yapın. Daha sonra, retinaya bakan açıklık ile kayıt odasının ortasına göz stoku yerleştirin. Göz stoğunu 20 dakika karanlıkta tutun.
Mikroelektrotu göz stoklarıuzun eksenine paralel olarak, mikroelektrotun retinaya erişmek için ortalanmış olacak şekilde yerleştirin. Aygıtları doğru yapılandırmaya yerleştirmek için stereoskopik mikroskop kullanın. Daha sonra, amplifikatörün köprü modunu seçerek referans ve kayıt elektrotları arasındaki voltaj farkını izleyin.
Elektrotbanyoya indirin ve retinanın üzerine yerleştirin. Mikroskobu çıkarın ve fotostimülatör lambasını göz stoklarıuzun eksenine paralel konumlandırın. Daha sonra, ani voltaj düşüşü tespit edilene kadar mikroelektrotu yavaşça indirin.
Daha sonra, fotoreseptör reseptör potansiyelini kaydetmek için bir test ışığı flaş teslim. Işık lı akımların uygun kayıtlarını elde etmek için sağlıklı bir fotoreseptör hücresinin iyi bir şekilde bozulması çok önemlidir. Bu işlemde, veri toplama yazılımında genliği tutarak hücrenin ölçülen dinlenme membranı potansiyelindeki gerilimi kıskaca alır.
Ardından, amplifikatörün DSEVC modunu seçin. Amplifikatörün mod bölümünde, SEVC düğmesini seçin ve kolu Discont'a geçirin. SEVC pozisyonu.
Elektrot hızına göre belirlenen anahtarlama hızını 500 ila 1,000 hertz olarak ayarlayın. Bundan sonra, bir ışık flaş teslim ve uyarılmış iyon akı gözlemlemek. Daha sonra, Bir çift ışık darbesini teslim edin ve istenilen zaman aralığından sonra ikinci flaşı uygulayın.
Veri toplama yazılımıyla 10 kilohertz örneklemedeki akımları dijitalleştirin ve verileri çevrimdışı analize kaydedin. Burada iki nabız protokolü gösteriliyor. Işık uyaranları sıfır milisaniye ve 700 milisaniye uygulandı.
Bu rakam duyarsızlaşmadan kaynaklanan iyileşmeyi gösteriyor. Burada gecikme kurtarma, burada zirve akım kurtarma, ve burada duyarsızlaştırma süresi sabit tau kurtarma olduğunu. Deneyler sıfır saat sirkadiyen zamanda yapıldı.
Bu şekil, ciyatüzamanının bir fonksiyonu olarak duyarsızlaşmanın iyileşmesini göstermektedir. Bu iP kurtarma, bu L kurtarma, ve bu tau kurtarma, ve bu grafik ağırlıklı zaman sabitleri gösterir. Bifatik işlemler bir okla işaretlenir.
Bir kez hakim, bu teknik iki saat içinde yapılabilir, düzgün yapılırsa. Bu prosedürü çalışırken, düşük gürültü ve düşük sızıntı akımı, fotoreseptör bozukluğu amacı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, farmakolojik tahliller gibi diğer yöntemler, belirli kanalların katılımı gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir, belirli kanalların katılımı gibi, reseptörler, veya sinyal yolları.
Bu teknik, geliştirilmesinden sonra nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların fotoreseptör hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerinin sirkadiyen zaman bağımlılığını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücre içi kayıt tekniğini kullanarak ışıkla aktive edilmiş transdüksiyon akımının duyarsızlaştırılması ve geri kazanımı nın nasıl incelenebildiğini iyi anlamalısınız.
