El objetivo general de este procedimiento es estudiar la desensibilización y la recuperación de sensibilidad de los fotorreceptores de cangrejo de río en función del tiempo circadiano, utilizando grabaciones eléctricas intercelulares de células fotorreceptores en poblaciones oculares aisladas, empleando la configuración discontinua de la abrazadera de voltaje conmutada de un solo electrodo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la dependencia del tiempo circadiano de tantas propiedades electrofisiológicas de fotorreceptores en la inactivación y la recuperación. La principal ventaja de esta técnica, es que permite la medición de la actividad eléctrica de los fotorreceptores.
A pesar de la dificultad para aislar las células y sin perturbar el ambiente intracelular. Demostrando este procedimiento estarán las doctoras Carolina Barriga-Montoya y Araceli de la O-Maritnez, colaboradoras de nuestro laboratorio. Para preparar el electrodo intracelular, tire del tubo capilar de vidrio con un tirador de micropipeta para obtener una punta delgada con una pequeña abertura.
A continuación, llene el vaso capilar tirado con una solución de cloruro de potasio 2,7 molares por capilaridad y luego, llene la mitad de la pipeta con una aguja de inyección fina. Si es necesario, toque la pipeta de electrodos para eliminar las burbujas de aire. Después de eso, coloque el electrodo en su soporte.
Conecte el soporte a la etapa del cabezal del amplificador con el amplificador. Después de eso, coloque la etapa del cabezal del soporte del electrodo con un micromaniprógrafo 3D estable. Baje el electrodo hasta que la solución de baño cubra su punta.
Seleccione el modo de puente del amplificador y mida la resistencia del electrodo. Asegúrese de que la resistencia es de unos 50 megamios. Nulo la corriente de desplazamiento y compensar los transitorios capacitivos utilizando el botón de posición de retención en la abrazadera de voltaje de sección del amplificador y el botón de neutralización de capacitancia en la sección Microelectrode 1 del amplificador.
Para construir el sistema de superfuerte, vierta la solución de baño en un recipiente adecuado y conéctela a un conjunto de tubos de riego, conectando así la cámara de grabación. Utilice un sistema de superfusión impulsado por gravedad. Regular el caudal a 0,5 mililitros por segundo.
Conecte la cámara a un dispositivo de succión. Regular el sistema de aspiración de la solución con una bomba de vacío de tal manera que el volumen total de la cámara de grabación no varíe. Para aislar el caldo de ojos de un cangrejo de río adulto, deséalo de la base con un par de tijeras finas.
Haz una abertura de un milímetro cuadrado en la córnea dorsal usando una cuchilla de afeitar para acceder a la retina. A continuación, coloque el material ocular en el centro de la cámara de grabación con la abertura de la retina hacia arriba. Mantenga el ojo en la oscuridad durante 20 minutos.
Coloque el microelectrodo paralelo al eje longitudinal de las poblaciones oculares de tal manera que el microelectrodo esté centrado para acceder a la retina. Utilice un microscopio estereoscópico para colocar los dispositivos en la configuración correcta. A continuación, supervise la diferencia de voltaje entre los electrodos de referencia y de grabación seleccionando el modo de puente del amplificador.
Baje el electrodo en el baño y colóquelo justo sobre la retina. Retire el microscopio y coloque la lámpara de fotostimulador paralela al eje longitudinal de las existencias oculares. A continuación, baje lentamente el microelectrodo hasta que se detecte una caída repentina de tensión.
Posteriormente, proporcione un flash de luz de prueba para registrar el potencial receptor del fotorreceptor. Para obtener las grabaciones adecuadas de corrientes provocadas por la luz, es fundamental hacer un buen deterioro de una célula fotorreceptor saludable. En este procedimiento, sujete la tensión al potencial de membrana de reposo medido de la célula seleccionando la amplitud de retención en el software de adquisición de datos.
A continuación, seleccione el modo DSEVC del amplificador. En la sección de modo del amplificador, seleccione el botón SEVC y cambie la palanca a la Discont. Posición SEVC.
Ajuste la velocidad de conmutación a 500 a 1.000 hercios, según lo determinado por la velocidad del electrodo. Después de eso, entregar un destello de luz y observar el flujo de iones evocado. A continuación, entregue un par de pulsos de luz y aplique el segundo flash después de un intervalo de tiempo deseado.
Digitalice las corrientes a 10 kilohercios de muestreo con el software de adquisición de datos y guarde los datos para el análisis fuera de línea. Aquí se muestra un protocolo de dos pulsos. Los estímulos de luz se aplicaron a cero milisegundos y 700 milisegundos.
Esta figura muestra la recuperación de la desensibilización. Aquí está la recuperación de latencia, aquí está la recuperación de corriente máxima, y aquí está la recuperación constante de tiempo de desensibilización constante. Los experimentos se realizaron a las horas cero de la hora circadiana.
Esta figura muestra la recuperación de la desensibilización en función del tiempo circadiano. Esta es la recuperación de iP, esto es recuperación de L, y esto es recuperación tau, y este gráfico muestra las constantes de tiempo ponderadas. Los procesos bifásicos se marcan con una flecha.
Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en dos horas, si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar apuntar a un bajo ruido y baja corriente de fuga, deterioro del fotorreceptor. Después de este procedimiento, se pueden hacer otros métodos, como los ensayos farmacológicos, con el fin de responder a preguntas adicionales, como la participación de canales particulares, receptores, o vías de señalización.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran la dependencia del tiempo circadiano de las propiedades electrofisiológicas de las células fotorreceptoras. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo estudiar la desensibilización y la recuperación de la corriente de transducción activada por luz mediante el uso de la técnica de grabación intracelular.
