Общая цель этой процедуры заключается в изучении десенсибилизации и восстановления чувствительности фоторецепторов раков в качестве функции циркадного времени, используя межклеточные электрические записи фоторецепторных клеток в изолированных глазных запасах, используя прерывистую конфигурацию зажима напряжения одного электрода. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как циркадная зависимость времени от многих электрофизиологических свойств фоторецепторов в инактивации и восстановлении. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет измерять электрическую активность фоторецепторов.
Несмотря на трудности с изоляцией клеток и не нарушая внутриклеточной среды. Демонстрацией этой процедуры будут врачи Каролина Баррига-Монтойя и Арасели де ла О-Маритнес, сотрудники нашей лаборатории. Чтобы подготовить внутриклеточный электрод, потяните стеклянную капиллярную трубку с помощью шкива микропипетры, чтобы получить тонкий наконечник с небольшим отверстием.
Затем заполните вытащил капиллярного стекла с 2,7-молярного раствора хлорида калия по капиллярности, а затем, заполнить половину пипетки с тонкой иглой инъекции. При необходимости коснитесь электродной пипетки, чтобы устранить пузырьки воздуха. После этого поместите электрод на его держатель.
Подключите держатель к этапу головы усилителя с усилителем. После этого располагаем головной сценой держателя электрода со стабильным 3-D микроманипулятором. Опустите электрод до тех пор, пока раствор ванны не покрывает его кончик.
Выберите режим моста усилителя и измерьте сопротивление электрода. Убедитесь, что сопротивление составляет около 50 мегаохм. Обнулить офсетный ток и компенсировать емкостные переходные с помощью кнопки положения удерживателя в зажиме напряжения секции усилителя и кнопки нейтрализации емкости в разделе Microelectrode 1 усилителя.
Чтобы построить супер термоядерную систему, вылейте раствор ванны в подходящий сосуд и соедините его с оросительным трубным набором, тем самым подключив камеру записи. Используйте гравитационную систему суперфузии. Регулировать скорость потока до 0,5 миллилитров в секунду.
Подключите камеру к всасывающее устройство. Регулировать раствор всасывающей системы с помощью вакуумного насоса таким образом, чтобы общий объем записывающей камеры не меняться. Чтобы изолировать глазной запас взрослого рака, отсоедините его от основания ножницами.
Сделайте отверстие одного квадратного миллиметра в спинной роговицы с помощью лезвия бритвы для доступа к сетчатке. Затем поместите глазной запас в центре камеры записи с отверстием для сетчатки вверх. Держите глаз в темноте в течение 20 минут.
Поместите микроэлектрод параллельно продольной оси глазных запасов таким образом, чтобы микроэлектронные центры для доступа к сетчатке. Используйте стереоскопический микроскоп, чтобы поместить устройства в правильную конфигурацию. Далее, контролировать разницу напряжения между ссылкой и записи электродов, выбрав режим моста усилителя.
Опустите электрод в ванну и поместите его прямо над сетчаткой. Удалить микроскоп и положение фотостимулятор лампы параллельно глаз запасов продольной оси. Затем медленно опустите микроэлектрод до тех пор, пока не будет обнаружено внезапное падение напряжения.
Впоследствии, доставить вспышку испытательного света для записи потенциала рецептора фоторецептора. Для получения соответствующих записей световых тока крайне важно сделать хорошее нарушение здоровой фоторецепторной клетки. В этой процедуре, зажим напряжения на измеренном потенциале мембраны отдыха клетки путем выбирать держать амплитуду в програмном обеспечении приобретения данных.
Затем выберите режим DSEVC усилителя. В разделе режима усилителя выберите кнопку SEVC и переключитесь рычаг на Discont. Позиция SEVC.
Установите скорость переключения до 500-1000 герц, определяемую скоростью электрода. После этого доставь световую вспышку и наблюдайте вызываемый ионный поток. Затем доставь пару световых импульсов и нанесите вторую вспышку после желаемого интервала времени.
Оцифровка тока на 10 килогерц выборки с программным обеспечением для сбора данных и сохранить данные для автономного анализа. Здесь показан двухимпульсный протокол. Световые стимулы применялись при нулевых миллисекундах и 700 миллисекундах.
Эта цифра свидетельствует о восстановлении после десенсибилизации. Вот восстановление задержки, вот пик текущего восстановления, и вот время десенсибилизации постоянного восстановления тау. Эксперименты проводились в нулевые часы циркадного времени.
Эта цифра показывает восстановление после десенсибилизации как функции циркадного времени. Это восстановление iP, это восстановление L, и это восстановление тау, и этот график показывает взвешенные константы времени. Бифазные процессы отмечены стрелкой.
После освоения, этот метод может быть сделано в течение двух часов, если это сделано правильно. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы стремиться к низкому шуму и низкой утечки тока, фоторецептор нарушения. После этой процедуры, другие методы, как фармакологические анализы, может быть сделано для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как участие конкретных каналов, рецепторов, или сигнальных путей.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области нейробиологии, чтобы исследовать циркадную зависимость времени электрофизиологических свойств клеток фоторецептора. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как изучать десенсибилизацию и восстановление светоактивного трансдукционного тока с помощью внутриклеточной техники записи.
