O objetivo geral deste procedimento é estudar a dessensibilização e a recuperação da sensibilidade dos fotorreceptores de lagostim em função do tempo circadiano, utilizando gravações elétricas intercelulares de células fotorreceptoras em estoques oculares isolados, empregando a configuração de grampo de tensão de eletrodo único descontínua. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neurobiologia, como a dependência do tempo circadiano de tantas propriedades eletro-fisiológicas de fotorreceptores na inativação e recuperação. A principal vantagem dessa técnica, é que permite a medição da atividade elétrica dos fotorreceptores.
Apesar da dificuldade de isolar as células e sem perturbar o meio intracelular. Demonstrando esse procedimento serão as médicas Carolina Barriga-Montoya e Araceli de la O-Maritnez, colegas de trabalho do nosso laboratório. Para preparar o eletrodo intracelular, puxe o tubo capilar de vidro com um puxador de micropipette para obter uma ponta fina com uma pequena abertura.
Em seguida, encha o vidro capilar puxado com solução de cloreto de potássio de 2,7 molar por capilaridade e, em seguida, encha metade da pipeta com uma agulha de injeção fina. Se necessário, toque na pipeta de eletrodo para eliminar bolhas de ar. Depois disso, coloque o eletrodo em seu suporte.
Conecte o suporte ao estágio da cabeça do amplificador com o amplificador. Na sequência, posicione o estágio da cabeça do suporte do eletrodo com um micromanipulador 3D estável. Abaixe o eletrodo até que a solução de banho cubra sua ponta.
Selecione o modo ponte do amplificador e meça a resistência ao eletrodo. Certifique-se de que a resistência é de cerca de 50 megaohms. Anular a corrente de deslocamento e compensar os transitórios capacitivos usando o botão de posição de retenção no grampo de tensão de seção do amplificador e o botão de neutralização da capacitância na seção Microelectrode 1 do amplificador.
Para construir o sistema de super fusão, despeje a solução de banho em um recipiente adequado e conecte-a a um conjunto de tubos de irrigação, conectando assim a câmara de gravação. Use um sistema de superfusão movido pela gravidade. Regular a vazão para 0,5 mililitros por segundo.
Conecte a câmara a um dispositivo de sucção. Regular o sistema de sucção da solução com uma bomba de vácuo de tal forma que o volume total da câmara de gravação não varie. Para isolar o estoque ocular de um lagostim adulto, desprezá-lo da base com uma tesoura fina.
Faça uma abertura de um milímetro quadrado na córnea dorsal usando uma lâmina de barbear para acessar a retina. Em seguida, coloque o estoque ocular no centro da câmara de gravação com a abertura para a retina voltada para cima. Mantenha o estoque de olhos na escuridão por 20 minutos.
Coloque o microeletrodo paralelo ao eixo longitudinal dos estoques oculares de tal forma que a microeletrídria esteja centrada no acesso à retina. Use um microscópio estereoscópico para colocar os dispositivos na configuração correta. Em seguida, monitore a diferença de tensão entre os eletrodos de referência e gravação selecionando o modo ponte do amplificador.
Abaixe o eletrodo no banho e coloque-o sobre a retina. Remova o microscópio e posicione a lâmpada fototimuladora paralela ao eixo longitudinal dos estoques oculares. Em seguida, abaixe lentamente o microeletrodo até que uma queda repentina de tensão seja detectada.
Posteriormente, entregue um flash de luz de teste para registrar o potencial do receptor do fotorreceptor. Para obter gravações adequadas de correntes provocadas pela luz, é fundamental fazer um bom prejuízo de uma célula fotorreceptora saudável. Neste procedimento, fixar a tensão no potencial de membrana de repouso medido da célula, selecionando a amplitude de retenção no software de aquisição de dados.
Em seguida, selecione o modo DSEVC do amplificador. Na seção de modo do amplificador, selecione o botão SEVC e mude a alavanca para o Disconte. Posição sevc.
Defina a taxa de comutação para 500 a 1.000 hertz, conforme determinado pela velocidade do eletrodo. Depois disso, entregue um flash de luz e observe o fluxo de íons evocado. Em seguida, entregue um par de pulsos de luz e aplique o segundo flash após um intervalo de tempo desejado.
Digitalize as correntes em amostragem de 10 kilohertz com o software de aquisição de dados e salve os dados para análise off-line. Mostrado aqui é um protocolo de dois pulsos. Estímulos leves foram aplicados a zero milissegundos e 700 milissegundos.
Este número mostra a recuperação da dessensibilização. Aqui está a recuperação da latência, aqui está o pico de recuperação atual, e aqui está o tempo de dessensibilização constante de recuperação tau. Os experimentos foram realizados a zero horas de circadiano.
Este número mostra a recuperação da dessensibilização em função do tempo circadiano. Esta é a recuperação do iP, esta é a recuperação de L, e esta é a recuperação de tau, e este gráfico mostra as constantes de tempo ponderadas. Os processos bifásicos são marcados com uma flecha.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de mirar em um baixo ruído e baixa corrente de vazamento, deficiência fotorreceptora. Após esse procedimento, outros métodos, como ensaios farmacológicos, podem ser feitos para responder a perguntas adicionais, como o envolvimento de determinados canais, receptores ou vias de sinalização.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da neurobiologia explorarem a dependência do tempo circadiano das propriedades eletrofisiológicas das células fotorreceptoras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar a dessensibilização e recuperação da corrente de transdução ativada pela luz usando a técnica de gravação intracelular.
