血栓烷 A2 受体基因 C924T 多态性的研究方法

这种方法可以帮助回答血栓形成和血栓场中的关键问题，识别更易感染动脉瘤过程的受试者，特别是用阿司匹林治疗的高危患者。该技术的主要优点是价格低廉，使用简单，方便，效率高，能够快速识别C924T多态性。虽然这种方法可以提供对动脉瘤病场的洞察，它也可以应用于其他系统，如涉及个性化药物或特定药物的多态性，以了解药理学个体反应。

演示这个程序的将是塞巴斯蒂安诺·乌尔西医生，我们实验室的技术人员。要在 pH 8.0 下准备 Tris EDTA 缓冲液，在烧杯中加入 200 微升 0.5 摩尔 EDTA 和一毫升一摩尔三氯化物，然后将体积调整为 100 毫升无菌水，并在室温下储存。接下来，通过添加所有试剂，准备一升10X电泳缓冲液的库存溶液，然后在室温下储存缓冲液。

接下来，通过添加所有试剂来准备凝胶加载染料，然后用无菌水将体积带到 100 毫升。一旦准备好，将染料储存在摄氏四度，几个月后。在 50 毫升 10X TBE 缓冲液中加入 450 毫升水，以准备 1X TBE 缓冲液。

在 200 毫升 1X TBE 缓冲液中加入 4 克阿加罗斯，在 600 毫升烧杯中加入，以准备 200 毫升 2%的 agarose 凝胶。在室温下储存的凝固的加糖凝胶可以在沸水浴中重新溶解，在60度下15至20分钟，或在微波炉中再溶解35分钟，加入少量水，以补偿加糖浓度的增加。在磁性搅拌器上搅拌烧杯约五分钟，直到气糖悬浮，然后在热盘上加热红糖约 10 分钟或在微波炉中搅拌约 3 分钟，使其完全溶解。

DNA纯化后，通过移液管多次轻轻混合新鲜DNA样本。必须获得从人体样本中提取的高质量模板DNA的10至50纳米。因此，我们更喜欢使用自动DNA纯化，而不是半自动或手动纯化。

要开始纯化，首先通过测量260、280和320纳米的吸收量来量化和计算DNA的纯度，然后使用无菌水稀释样品。接下来，校准分光光度计。为了构成PCR反应，添加所有试剂，在0.2毫升微增塑管中准备25微升PCR主混合。

然后将 PCR 管放在自动热循环器中，并放大纯化的 DNA 样本。程序完成后，将管子留在摄氏四度，停止反应。在DNA的自由水中加入10X酶缓冲液，每微升限制酶5个单位，体积为22.5微升。

接下来，将 2.5 微升 PCR 产品添加到新的 PCR 管中，然后将 22.5 微升的限制性消化混合物添加到 PCR 产品中。在37摄氏度下孵育PCR产品限制消化主混合物4小时，然后每毫升添加0.5微克溴酸钠，使凝胶染色10分钟。将凝胶倒入凝胶托盘上，将井梳放在一起，使凝胶凝固。

现在用 1X TBE 缓冲液倒凝胶盒，直到凝胶被覆盖。使用精细提示将六微升的扩增消化DNA加载到凝胶中形成的孔中，然后在与样品平行的单独井中添加DNA标记物。接下来，打开电泳装置。

为了识别TBXA2R基因中的C924T遗传多态性，进行了RFLP分析。在凝胶中，它显示两个波段在395和144碱基对的主要等位基因的野生类型版本，而一个波段在539基对的突变版本的次要等位基因被看到表示没有削减的限制酶。有趣的是，395、144 和 539 基对的三个波段存在异质等位基因。

接下来，使用序列分析确认C924T多态性。突出显示的序列表示多态性。一旦掌握，这项技术可以完成约8小时，如果它执行得当。

在尝试此过程时，必须记住，此方法只能用于工作会话中的少量剪贴画和少量示例。按照此过程，可以执行其他方法，如狙击分析，以回答其他问题，如涉及动脉系统过程的其他通路的重要性。该技术在开发之后，为分子生物学领域的研究人员探索在开始发育和进展中表现突出的基因变异铺平了道路。

观看此视频后，您应该了解如何使用对 PCR-RFLP 样品的凝胶电泳分析来评估有关 C924T 多态性的血箱 A2 受体基因型。不要忘记，使用溴化钛和紫外线光源可能极其危险，执行本程序时应始终采取预防措施，如手套、安全眼镜或面罩和其他防护装置。