يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الجلطات والاختزالات لتحديد الموضوعات الأكثر عرضة لعمليات التهرمثر في المرضى ذوي الخطورة العالية على وجه الخصوص الذين يعالجون بالأسبرين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه غير مكلفة وبسيطة للاستخدام ومريحة، لديها كفاءة عالية ويسمح بسرعة تحديد متعدد الأشكال C924T. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في مجال atherothrombosis، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى مثل تعدد الأشكال التي تنطوي على الطب الشخصي أو أدوية محددة من أجل فهم الاستجابة الفردية الدوائية.
سوف يكون الإجراء هو الطبيب سيباستيانو أورسي، وهو فني من مختبرنا. لإعداد المخزن المؤقت تريس EDTA في درجة حرارة 8.0، إضافة 200 ميكرولتر من 0.5 EDTA المولى ومليلتر واحد من كلوريد تريس الضروس في منقار، ثم ضبط وحدة التخزين إلى 100 ملليلتر مع الماء المعقم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. المقبل, إعداد لتر واحد من 10X حل المخزون من العازلة الكهربائية من خلال إضافة جميع الكواشف, ثم تخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة.
المقبل، وإعداد هلام صبغة التحميل عن طريق إضافة جميع الكواشف ثم جلب وحدة التخزين إلى 100 ملليلتر مع الماء المعقم. مرة واحدة على استعداد، وتخزين الصبغة في أربع درجات مئوية لبضعة أشهر. إضافة 450 ملليلتر من الماء إلى 50 ملليلتر من 10X TBE العازلة لإعداد حل من 1X TBE العازلة.
إضافة أربعة غرامات من agarose في 200 ملليلتر من 1X TBE العازلة معا في منقار 600 ملليلتر لإعداد 200 ملليلتر من هلام agarose 2٪. يمكن إعادة تحديد هلام agarose المُزدّد المخزن في درجة حرارة الغرفة على حمام ماء مغلي عند درجة 60 لمدة 15 إلى 20 دقيقة أو في فرن الميكروويف لمدة 35 دقيقة عن طريق إضافة كمية صغيرة من الماء لتعويض الزيادة في تركيز agarose. الحفاظ على اثارة القارق على خلاط المغناطيسي لمدة خمس دقائق تقريبا حتى يتم تعليق agarose ثم تسخين agarose على لوحة ساخنة لمدة 10 دقائق تقريبا أو في فرن الميكروويف لمدة ثلاث دقائق لأنها تذوب تماما.
بعد تنقية الحمض النووي، مزيج بلطف عينات الحمض النووي الطازجة عن طريق أنابيب الأنابيب عدة مرات. ومن الضروري الحصول على 10 إلى 50 نانوغرام من الحمض النووي قالب جيد الجودة المستخرجة من عينات بشرية. لهذا السبب، نحن نفضل استخدام تنقية الحمض النووي الآلي بدلا من شبه الآلي أو دليل واحد.
للبدء في تنقية، أولاً تحديد وحساب نقاء الحمض النووي عن طريق قياس الماصات في 260 و 280 و 320 نانومتر، ثم تمييع العينات باستخدام الماء المعقم. بعد ذلك، معايرة مقياس الطيف. لتشكيل تفاعل PCR، إضافة جميع الكواشف لإعداد 25 ميكرولترات من المزيج الرئيسي PCR في أنبوب 0.2 ملليلتر microamplification.
ثم ضع أنابيب PCR في ثيرسيكلر آلي وتضخيم عينات الحمض النووي المنقى. بمجرد انتهاء البرنامج ، أوقف التفاعل بترك الأنابيب عند أربع درجات مئوية. إضافة 10X إنزيم العازلة خمس وحدات لكل انزيم تقييد ميكرولتر في المياه الحرة للحمض النووي إلى حجم 22.5 ميكرولترات.
بعد ذلك، إضافة 2.5 ميكرولترات من المنتج PCR إلى أنبوب PCR جديد ثم إضافة 22.5 ميكرولتراترس من مزيج الهضم تقييد إلى المنتج PCR. احتضان المنتج PCR تقييد الهضم ماجستير مزيج في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات، ثم إضافة 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من بروميد الإتيهيدوم لطخة هلام لمدة 10 دقائق. صب هلام على علبة هلام مع مشط البئر في مكان هلام لترسيخ.
صب الآن مربع هلام مع 1X TBE العازلة حتى يتم تغطية هلام. استخدام نصائح غرامة لتحميل ستة ميكرولترات من الحمض النووي هضم تضخيمها في الآبار التي تشكلت في هلام، ثم إضافة علامة الحمض النووي أيضا في موازاة بشكل جيد منفصل مع العينة. بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة الكهرباء.
من أجل تحديد تعدد الأشكال الجينية C924T في الجين TBXA2R، يتم تحليل RFLP. في الجل، فإنه يعرض اثنين من العصابات في 395 و 144 أزواج قاعدة للنسخة البرية من نوع أليل الكبرى، في حين أن الفرقة واحدة في 539 أزواج قاعدة للنسخة متحولة من أليل طفيفة ينظر مما يدل على عدم قطع من قبل انزيم تقييد. ومن المثير للاهتمام، وثلاثة فرق في 395، 144، و 539 أزواج قاعدة موجودة لالليل heterozygous.
بعد ذلك، يتم تأكيد تعدد الأشكال C924T باستخدام تحليل التسلسل. يمثل التسلسل المميز تعدد الأشكال. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في حوالي ثماني ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن هذه الطريقة يمكن استخدامها فقط لعدد قليل من القصاصات و عدد قليل من العينات في جلسة عمل. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل القصاصة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل أهمية المسارات الأخرى التي تنطوي على عمليات الثرموتهرومبوتيك. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الجزيئية لاستكشاف الاختلافات الوراثية المعلقة في هذا التطور والتطور في البداية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم النمط الجيني مستقبلات ثرومبوإكسان A2 فيما يتعلق بتعدد الأشكال C924T باستخدام تحليل جل الكهرباء من عينات PCR-RFLP. لا تنس أن العمل مع بروميد الإثيديوم ومصادر الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات، نظارات السلامة، أو قناع الوجه وغيرها من الأجهزة الواقية دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
