Bu yöntem, özellikle aspirin le tedavi edilen yüksek riskli hastalarda aterothrombotik süreçlere daha duyarlı konuları tanımlayan tromboz ve hemostaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı ucuz olması, kullanımı kolay, kullanışlı, yüksek verimli ve C924T polimorfizmlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntem aterothrombosis alana içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda farmakolojik bireysel yanıtı anlamak için kişiselleştirilmiş ilaç veya özel ilaçlar içeren polimorfizmler gibi diğer sistemlere uygulanabilir.
Prosedürü gösteren Doktor Sebastiano Ursi, laboratuarımızdan bir teknisyen. Tris EDTA tamponu pH 8.0'da hazırlamak için, 0.5 molar EDTA 200 mikrolitre ve bir beher bir azı tris klorür bir mililitre ekleyin, sonra steril su ile 100 mililitre hacim ayarlayın ve oda sıcaklığında saklamak. Daha sonra, tüm reaktifler ekleyerek elektroforez tampon 10X stok çözeltisi bir litre hazırlamak, sonra oda sıcaklığında tampon saklayın.
Daha sonra, tüm reaktifler ekleyerek jel yükleme boya hazırlamak sonra steril su ile 100 mililitre hacmi getirmek. Bir kez hazırlandıktan sonra, birkaç ay için dört santigrat derecede boya saklayın. 1X TBE tamponunun çözeltisini hazırlamak için 50 mililitre 10 X TBE tamponuna 450 mililitre su ekleyin.
200 mililitre 1X TBE tamponunda 4 gram agagül ekleyin ve %2'lik agarose jelin 200 mililitresini hazırlayın. Oda sıcaklığında depolanan katılaşmış agarose jel, 60 derecede kaynar su banyosunda 15-20 dakika veya mikrodalga fırında 35 dakika boyunca küçük bir hacim ekleyerek agarose konsantrasyonundaki artışı telafi etmek için küçük bir hacim ekleyerek yeniden çözülebilir. Agarose askıya alınana kadar yaklaşık beş dakika boyunca bir manyetik karıştırıcı üzerinde kabı karıştırmaya devam edin sonra yaklaşık 10 dakika boyunca bir sıcak tabak ta agarose ısı veya tamamen çözülmesi için üç dakika mikrodalga fırında.
DNA'nın arınması ndan sonra, taze DNA örneklerini tüpleri birkaç kez borulandırarak hafifçe karıştırın. İnsan örneklerinden elde edilen kaliteli bir şablon DNA'sının 10 ila 50 nanogramını elde etmek zorunludur. Bu nedenle, yarı otomatik veya manuel bir yerine otomatik bir DNA arınma kullanmayı tercih ediyoruz.
Arınmaya başlamak için, önce 260, 280 ve 320 nanometredeki emicileri ölçerek DNA'nın saflığını ölçün ve hesaplayın, sonra da numuneleri steril su kullanarak seyreltin. Sonra, spektrofotometreyi kalibre edin. PCR reaksiyonu oluşturmak için, 0,2 mililitrelik mikroamplifikasyon tüpünde 25 mikrolitre PCR ana karışımı hazırlamak için tüm reaktifleri ekleyin.
Daha sonra PCR tüplerini otomatik bir termocycler yerleştirin ve saflaştırılmış DNA örneklerini yükseltin. Program bittikten sonra tüpleri dört santigrat derecede bırakarak reaksiyonu durdurun. 22,5 mikrolitrelik bir hacme DNA'nın serbest suyundaki mikrolitre restriksiyon enzimi başına 10X enzim tamponu beş birim ekleyin.
Daha sonra, yeni bir PCR tüpüne 2,5 mikrolitre PCR ürünü ekleyin ve ardından 22,5 mikrolitre kısıtlama sindirim karışımını PCR ürününe ekleyin. Dört saat boyunca 37 santigrat derece PCR ürün kısıtlama sindirim ana karışımı kuluçka, sonra 10 dakika boyunca jel leke Ethidium bromür mililitre başına 0,5 mikrogram ekleyin. Jel katılaşmak için yerinde iyi tarak ile jel tepsiye jel dökün.
Şimdi jel kaplı olana kadar 1X TBE tampon ile jel kutusu dökün. Jel de oluşan kuyularda güçlendirilmiş sindirilmiş DNA altı mikrolitre yüklemek için ince ipuçları kullanın, sonra da örnek ile ayrı bir iyi paralel bir DNA işareti ekleyin. Sonra, elektroforez ünitesini açın.
TBXA2R genindeki C924T genetik polimorfizmini belirlemek için RFLP analizi yapılır. Jelde, majör alelin vahşi tipi versiyonu için 395 ve 144 baz çiftlerinde iki bant gösterirken, küçük alelin mutant versiyonu için 539 baz çiftinde tek bir bant, restriksiyon enziminin kesilmediğini gösterir. İlginçtir, 395, 144 ve 539 baz çiftleri üç bantları heterozigot alel için mevcuttur.
Daha sonra, C924T polimorfizmi dizi analizi kullanılarak doğrulanır. Vurgulanan sıra polimorfizmi temsil eder. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa yaklaşık sekiz saat içinde yapılabilir.
Bu yordamı denerken, bu yöntemin yalnızca az sayıda parçacık ve bir çalışma oturumundaki birkaç örnek için kullanılabileceğini unutmamak gerekir. Bu prosedürü takiben, aterothrombotik süreçleri içeren diğer yolların önemi gibi ek soruları cevaplamak için snip analizi gibi diğer yöntemler de yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların bu başlangıç gelişimi ve ilerlemesinde göze çarpan genetik varyasyonları keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Bu videoyu izledikten sonra, PCR-RFLP örneklerinin jel elektroforez analizini kullanarak C924T polimorfizmi açısından Trombone A2 reseptör genotipinin nasıl değerlendirildi diye iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ethidium bromür ve UV ışık kaynakları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven, güvenlik gözlüğü veya yüz maskesi ve diğer koruyucu cihazlar gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.
