Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de trombose e hemostasia identificando indivíduos mais suscetíveis a processos atherothromboticos, em particular pacientes de alto risco tratados com aspirina. A principal vantagem dessa técnica é que ela é barata, simples de usar, conveniente, tem alta eficiência e permite a identificação rápida dos polimorfismos C924T. Embora este método possa fornecer insights sobre o campo da atherotrose, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como polimorfismos envolvendo medicina personalizada ou medicamentos específicos, a fim de entender a resposta individual farmacológica.
Demonstrando o procedimento estará o Doutor Sebastiano Ursi, técnico do nosso laboratório. Para preparar o tampão Tris EDTA no pH 8.0, adicione 200 microliters de 0,5 molar EDTA e um mililitro de um cloreto tris molar em um béquer, em seguida, ajuste o volume para 100 mililitros com água estéril e armazene à temperatura ambiente. Em seguida, prepare um litro de solução de estoque 10X de tampão de eletroforese adicionando todos os reagentes e, em seguida, armazene o buffer à temperatura ambiente.
Em seguida, prepare o corante de carregamento de gel adicionando todos os reagentes e, em seguida, leve o volume para 100 mililitros com água estéril. Uma vez preparado, armazene o corante a quatro graus Celsius por alguns meses. Adicione 450 mililitros de água a 50 mililitros de tampão TBE 10X para preparar uma solução de tampão 1X TBE.
Adicione quatro gramas de agarose em 200 mililitros de tampão 1X TBE juntos em um béquer de 600 mililitros para preparar 200 mililitros de gel de 2%agarose. Gel de agarose solidificado armazenado à temperatura ambiente pode ser redissolved sobre um banho de água fervente a 60 graus por 15 a 20 minutos ou em um forno micro-ondas por 35 minutos adicionando um pequeno volume de água para compensar o aumento da concentração de ágarose. Continue mexendo o béquer em uma batedeira magnética por aproximadamente cinco minutos até que a agarose esteja suspensa, em seguida, aqueça a agarose em uma placa quente por cerca de 10 minutos ou em um forno de micro-ondas por três minutos para que ele se dissolva completamente.
Após a purificação do DNA, misture suavemente as amostras de DNA frescos por tubos de pipetação várias vezes. É obrigatório obter de 10 a 50 nanogramas de um DNA modelo de boa qualidade extraído de amostras humanas. Por essa razão, preferimos usar uma purificação automatizada de DNA em vez de uma semi-automatizada ou manual.
Para começar a purificação, primeiro quantifique e calcule a pureza do DNA medindo os absorventes em 260, 280 e 320 nanômetros, em seguida, diluir as amostras usando água estéril. Em seguida, calibrar o espectrômetro. Para constituir a reação pcr, adicione todos os reagentes para preparar 25 microliters de mix mestre PCR em um tubo de microamplificação de 0,2 mililitro.
Em seguida, coloque os tubos PCR em um termociclador automatizado e amplie as amostras de DNA purificadas. Uma vez que o programa termine, pare a reação deixando os tubos a quatro graus Celsius. Adicione 10X tampão de enzima cinco unidades por enzima de restrição de microliter na água livre do DNA a um volume de 22,5 microliters.
Em seguida, adicione 2,5 microliters de produto PCR a um novo tubo PCR e adicione os 22,5 microliters de mistura de digestão de restrição ao produto PCR. Incubar a mistura mestre de digestão de restrição do produto PCR a 37 graus Celsius por quatro horas e, em seguida, adicione 0,5 micrograma por mililitro de brometo de ethidium para manchar o gel por 10 minutos. Despeje o gel na bandeja de gel com o pente-bom no lugar para o gel solidificar.
Agora despeje a caixa de gel com tampão 1X TBE até que o gel esteja coberto. Use dicas finas para carregar seis microliters do DNA digerido amplificado nos poços formados no gel, em seguida, adicione um marcador de DNA também em um bem paralelo separado com a amostra. Em seguida, ligue a unidade de eletroforese.
Para identificar o polimorfismo genético C924T no gene TBXA2R, a análise RFLP é feita. No gel, ele exibe duas bandas em 395 e 144 pares de base para a versão wild-type do alelo principal, enquanto uma única banda em 539 pares de base para a versão mutante do alelo menor é visto indicando nenhum corte pela enzima de restrição. Curiosamente, três bandas de 395, 144 e 539 pares de base estão presentes para o alelo heterozigoso.
Em seguida, o polimorfismo C924T é confirmado usando análise de sequência. A sequência destacada representa o polimorfismo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de oito horas se for realizada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este método só pode ser usado para um pequeno número de cortes e para poucas amostras em uma sessão de trabalho. Após esse procedimento, outros métodos como a análise de cortes podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como a importância de outras vias envolvendo processos atherothromboticos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia molecular explorarem variações genéticas destacadas neste desenvolvimento e progressão inacampeões.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar o genótipo receptor Thromboxane A2 no que diz respeito ao polimorfismo C924T usando a análise de eletroforese gel das amostras PCR-RFLP. Não se esqueça que trabalhar com brometo de ethidium e fontes de luz UV pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas, óculos de segurança ou uma máscara facial e outros dispositivos de proteção devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
