Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im Thrombose- und Hämostasefeld zu beantworten, die Probanden identifizieren, die anfälliger für atherothrombotische Prozesse sind, insbesondere hochriskante Patienten, die mit Aspirin behandelt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie kostengünstig, einfach zu bedienen, bequem ist, einen hohen Wirkungsgrad hat und eine schnelle Identifizierung der C924T-Polymorphismen ermöglicht. Obwohl diese Methode Einen Einblick in das Feld der Atherothrombose geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Polymorphismen mit personalisierter Medizin oder spezifischen Medikamenten angewendet werden, um die pharmakologische individuelle Reaktion zu verstehen.
Demonstriert wird das Verfahren von Doktor Sebastiano Ursi, einem Techniker aus unserem Labor. Um den Tris EDTA Puffer bei pH 8,0 vorzubereiten, fügen Sie 200 Mikroliter 0,5 Molaren EDTA und einen Milliliter eines Molaren-Trischlorids in einem Becher hinzu, stellen Sie dann das Volumen mit sterilem Wasser auf 100 Milliliter ein und lagern Sie es bei Raumtemperatur auf. Als nächstes bereiten Sie einen Liter 10X Stammlösung ElektrophoresePuffer durch Hinzufügen aller Reagenzien, dann speichern Sie den Puffer bei Raumtemperatur.
Als nächstes bereiten Sie den Gel-Ladefarbstoff vor, indem Sie alle Reagenzien hinzufügen und dann das Volumen mit sterilem Wasser auf 100 Milliliter bringen. Einmal zubereitet, lagern Sie den Farbstoff bei vier Grad Celsius für ein paar Monate. Fügen Sie 450 Milliliter Wasser zu 50 Milliliter 10X TBE Puffer hinzu, um eine Lösung von 1X TBE Puffer vorzubereiten.
Fügen Sie vier Gramm Agarose in 200 Milliliter 1X TBE Puffer zusammen in einem 600 Milliliter Becher, um 200 Milliliter 2%Agarose Gel vorzubereiten. Erstarrtes Agarosegel, das bei Raumtemperatur gelagert wird, kann über ein kochendes Wasserbad bei 60 Grad für 15 bis 20 Minuten oder in einer Mikrowelle für 35 Minuten wieder gelöst werden, indem eine kleine Wassermenge hinzugefügt wird, um den Anstieg der Agarosekonzentration auszugleichen. Rühren Sie das Becherglas auf einem Magnetmischer ca. fünf Minuten, bis die Agarose aufgehängt ist, und erhitzen Sie die Agarose auf einer Kochplatte für etwa 10 Minuten oder in einer Mikrowelle für drei Minuten, damit sie sich vollständig auflöst.
Mischen Sie die frischen DNA-Proben nach der Reinigung der DNA mehrmals durch Pipettieren von Rohren. Es ist obligatorisch, 10 bis 50 Nanogramm einer hochwertigen Vorlagen-DNA zu erhalten, die aus menschlichen Proben extrahiert wird. Aus diesem Grund bevorzugen wir eine automatisierte DNA-Reinigung anstelle einer halbautomatischen oder manuellen.
Um mit der Reinigung zu beginnen, quantifizieren und berechnen Sie zunächst die Reinheit der DNA, indem Sie die Absorber mit 260, 280 und 320 Nanometern messen und dann die Proben mit sterilem Wasser verdünnen. Kalibrieren Sie anschließend das Spektralphotometer. Um die PCR-Reaktion zu bilden, fügen Sie alle Reagenzien hinzu, um 25 Mikroliter PCR-Master-Mix in einem 0,2 Milliliter Mikroamplifliflifikationsrohr vorzubereiten.
Legen Sie dann die PCR-Röhren in einen automatisierten Thermocycler und verstärken Sie die gereinigten DNA-Proben. Sobald das Programm beendet ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Rohre bei vier Grad Celsius verlassen. Fügen Sie 10X Enzympuffer fünf Einheiten pro Mikroliter Restriktionsenzym in das freie Wasser der DNA zu einem Volumen von 22,5 Mikrolitern hinzu.
Als nächstes fügen Sie 2,5 Mikroliter PCR-Produkt zu einem neuen PCR-Rohr hinzu und fügen Sie dann die 22,5 Mikroliter Restriktionsverdauungsmix zum PCR-Produkt hinzu. Inkubieren Sie die PCR-Produkteinschränkung Verdauung Master-Mix bei 37 Grad Celsius für vier Stunden, dann fügen Sie 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid, um das Gel für 10 Minuten zu färben. Gießen Sie das Gel auf das Geltablett mit dem Brunnenkamm an Ort und Stelle für das Gel zu erstarren.
Gießen Sie nun die Gelbox mit 1X TBE Puffer, bis das Gel abgedeckt ist. Verwenden Sie feine Spitzen, um sechs Mikroliter der amplifizierten verdauten DNA in die im Gel gebildeten Brunnen zu laden, und fügen Sie dann auch einen DNA-Marker in einem separaten Brunnen parallel zur Probe hinzu. Schalten Sie als Nächstes die Elektrophoreseeinheit ein.
Um den genetischen Polymorphismus C924T im TBXA2R-Gen zu identifizieren, wird eine RFLP-Analyse durchgeführt. Im Gel zeigt es zwei Bänder bei 395 und 144 Basenpaare für die Wildtyp-Version des Hauptalleels, während ein einzelnes Band bei 539 Basenpaaren für die mutierte Version des Moll-Alleels gesehen wird, das keinen Schnitt durch das Restriktionsenzym anzeigt. Interessanterweise sind drei Bänder bei 395, 144 und 539 Basenpaaren für das heterozygote Allel vorhanden.
Als nächstes wird der C924T-Polymorphismus mittels Sequenzanalyse bestätigt. Die hervorgehobene Sequenz stellt den Polymorphismus dar. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Methode nur für eine kleine Anzahl von Schnipsen und die für wenige Beispiele in einer Arbeitssitzung verwendet werden kann. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Dienip-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Bedeutung anderer Wege mit atherothrombotischen Prozessen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Molekularbiologie, um genetische Variationen zu erforschen, die in dieser beginnenden Entwicklung und Progression herausragend sind.
Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Thromboxan-A2-Rezeptorgenotyp in Bezug auf den C924T-Polymorphismus mittels Gelelektrophoreseanalyse der PCR-RFLP-Proben bewerten können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethidiumbromid und UV-Lichtquellen extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrillen oder eine Gesichtsmaske und andere Schutzvorrichtungen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
