이 방법은 혈전증과 혈전증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 아스피린으로 치료받은 특히 고위험 환자에서 아테로스롬보틱 프로세스에 더 취약한 피험목을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 사용하기 쉽고 편리하며 고효율을 가지며 C924T 다형성을 신속하게 식별할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 atherothrombosis 필드에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 약리학적 인 개별 반응을 이해하기 위해 개인화 된 약 또는 특정 약물을 포함하는 다형성과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 세바스티아노 우르시 박사가 될 것입니다. pH 8.0에서 Tris EDTA 버퍼를 준비하려면 0.5 개의 어금니 EDTA 200 마이크로 리터와 1 개의 어금니 트리스 염화물 1 밀리리터를 비커에 넣고 부피를 멸균 물로 100 밀리리터로 조정하고 실온에서 보관하십시오. 다음으로, 모든 시약을 추가하여 전기 포하 버퍼의 10X 스톡 용액 1 리터를 준비한 다음 버퍼를 실온에 저장합니다.
다음으로, 모든 시약을 추가하여 젤 로딩 염료를 준비한 다음 멸균물로 100 밀리리터에 부피를 가져옵니다. 일단 준비되면 몇 달 동안 섭씨 4도에 염료를 보관하십시오. 1X TBE 버퍼의 용액을 준비하기 위해 450 밀리리터의 물을 10배 TBE 버퍼50 밀리리터에 추가합니다.
아가로즈 4그램을 600 밀리리터 비커에 1X TBE 버퍼 200 밀리리터에 넣고 2%아가로즈 젤200밀리리터를 준비합니다. 실온에서 저장된 고화화 아가로즈 젤은 15~20분 동안 60도 또는 전자레인지에 35분간 재해석하여 소량의 물을 첨가하여 아가로즈 농도의 증가를 보정할 수 있다. 아가로즈가 중단될 때까지 약 5분간 마그네틱 믹서에 비커를 저어준 다음, 뜨거운 접시에 아가로즈를 약 10분 간 가열하거나 전자레인지에서 3분간 가열하여 완전히 녹입니다.
DNA의 정화 후, 튜브를 여러 번 배관하여 신선한 DNA 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 인간 샘플에서 추출한 양질의 템플릿 DNA의 10~50나노그램을 획득하는 것은 필수입니다. 이러한 이유로, 우리는 반 자동 또는 수동 정제보다는 자동화 된 DNA 정제를 사용하는 것을 선호합니다.
정화를 시작하기 위해 먼저 260, 280 및 320 나노미터에서 흡수를 측정하여 DNA의 순도를 정량화한 다음 멸균물을 사용하여 샘플을 희석시 희석시 먼저 정량화한다. 다음으로 분광계를 보정합니다. PCR 반응을 구성하기 위해 모든 시약을 추가하여 0.2 밀리리터 미세 증폭 튜브에 PCR 마스터 믹스 25 마이크로리터를 준비합니다.
그런 다음 PCR 튜브를 자동화된 열순환기에 넣고 정제된 DNA 샘플을 증폭시합니다. 프로그램이 끝나면 튜브를 섭씨 4도에서 방치하여 반응을 중지하십시오. DNA의 무료 물에 마이크로리터 제한 효소당 10X 효소 버퍼 5단위를 22.5 마이크로리터의 부피에 추가합니다.
다음으로, 새로운 PCR 튜브에 PCR 제품의 2.5 마이크로리터를 추가한 다음 PCR 제품에 22.5 마이크로리터의 제한 소화 믹스를 추가합니다. PCR 제품 제한 소화 마스터 믹스를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양한 다음 에티듐 브로마이드 밀리리터당 0.5 마이크로그램을 추가하여 젤을 10분 동안 염색합니다. 젤 트레이에 젤을 부어 젤을 고화시키기 위해 잘 빗을 제자리에 놓습니다.
이제 젤이 덮여있을 때까지 1X TBE 버퍼로 젤 상자를 붓습니다. 미세 한 팁을 사용하여 젤에 형성 된 우물에 증폭 된 소화 된 DNA의 6 마이크로 리터를로드 한 다음 샘플과 평행하여 DNA 마커를 추가하십시오. 다음으로, 전기 전도 장치를 켭켜보시면 됩니다.
TBXA2R 유전자에서 C924T 유전다형성을 식별하기 위해 RFLP 분석이 수행된다. 겔에서, 그것은 주요 진상제의 야생 형 버전에 대한 395 및 144 베이스 쌍에서 두 개의 밴드를 표시, 반면 단일 밴드는 539 작은 진상유전자의 돌연변이 버전에 대한 베이스 쌍 제한 효소에 의해 절단을 나타내는 볼 수 있습니다. 흥미롭게도, 395, 144, 539 베이스 쌍의 세 밴드가 이종구스 알렐레에 존재한다.
다음으로, C924T 다형성은 서열 분석을 사용하여 확인된다. 강조 표시된 순서는 다형성을 나타냅니다. 일단 마스터되면, 제대로 수행되는 경우이 기술은 약 8 시간 안에 수행 할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 이 메서드는 소수의 스닙과 작업 세션에서 몇 가지 샘플에만 사용할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, snip 분석 과 같은 다른 방법은 atherothrombotic 프로세스와 관련된 다른 경로의 중요성과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 분자 생물학 분야의 연구원들이 이 시작 발달 및 진행에서 뛰어난 유전적 변이를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 비디오를 시청한 후, PCR-RFLP 샘플의 젤 전기포고증 분석을 사용하여 C924T 다형성과 관련하여 혈박산 A2 수용체 유전자형을 평가하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야 한다. 에티듐 브로마이드 및 UV 광원으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑, 안전 안경 또는 얼굴 마스크 및 기타 보호 장치와 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.
