用石英谐振器研究磷脂结合蛋白附件 a2 与固体支持的脂质层结合动力学的耗散微重法

该方法有助于研究脂质膜蛋白的方向。在我们的案例中，使用它来分析附件素与负磷脂的钙依赖结合。该技术的主要优点是，它无标签，敏感，定量，并可以实时观察到相互作用。

因此，可以直接分析实际结果。此技术也可以应用于其他系统，例如更复杂的微分子组件甚至细胞的相互作用。使用文本协议中描述的透明五毫摩尔脂质溶液。

将溶解的脂质在所需的摩尔比中组合在 10 毫升玻璃管中。使用干流氮蒸发有机溶剂。将脂质混合物留在高真空冻干系统中三小时，以去除溶剂的任何残留痕迹。

现在，将脂质膜重新在一毫升柠檬酸盐缓冲液中。在水浴中，在60摄氏度下孵育脂悬浮液30分钟，每五分钟用力旋转一次。该温度比混合物中熔脂的最高相变温度高出约 10 摄氏度。

同时，将装有直径50纳米孔径的聚碳酸酯膜预热，在过渡温度以上加热30分钟。将多层囊泡悬浮液装入预热挤出机中。轻轻通过聚碳酸酯膜31次，形成小单酰气囊或SUV。

保持温度高于过渡温度。将SUV悬浮液转移到两毫升塑料反应容器中，并加入柠檬酸盐缓冲液，将最终体积达到两毫升。在 2%SDS 溶液中孵育四个插入聚四氟乙烯支架的传感器至少 30 分钟。

然后用超纯水广泛清洗，以完全去除SDS，并使用干砷或氮气流进行尝试。使用等离子清洁系统完全清除任何污染物。为此，请将干传感器插入等离子清洗室中，排空室，然后用氧气冲洗三次。

然后，打开等离子清洁剂。使用真空、高射频功率和 10 分钟的处理时间。清洁运行后，关闭机器并拿出传感器。

使用钳子小心地将等离子清洁传感器停靠到四个流量室中。避免对可能导致泄漏的腔室和管子施加任何压力或躯干。在开放流模式下用柠檬酸盐缓冲器冲洗系统 10 分钟。

启动程序。开始使用软件记录第一个基本音调和音调的频率和耗散的任何变化，直到频率和耗散基线稳定。当基线稳定时，在柠檬酸盐缓冲液中应用 SUV 悬架。

使用反应容器，取出1.5毫升的死体积，然后在循环流模式下关闭系统。将频率耗散班再记录 10 分钟。当 SLB 稳定时，在开放流动模式下以所需的钙浓度平衡系统，使用运行缓冲液进行 40 分钟。

将蛋白质加入含有钙的运行缓冲液。在循环流模式下执行蛋白质的应用，直到达到平衡稳定状态。现在，在开放流动模式下的运行缓冲液中，通过将钙离子与五毫摩尔EGTA分离，分离结合的蛋白质。

在连续开放流模式下，使用 50 毫升双蒸馏水再生微平衡系统。从水容器中拆下管子，让系统运行干燥。小心地拆下晶体传感器，并使用聚四氟乙烯支架用 2%SDS 溶液清洁。

干燥放置传感器的流量模块内部的可见部分。此处显示，记录频率曲线和耗散位移位。增加脂质体后频率的显著下降，表明其吸收，因为缓冲填充的囊泡不是刚性的，而是粘弹性的，耗散增加。

随后，煤囊破裂。囊泡内缓冲液的伴随释放会降低吸附质量，直到达到稳定的高原。附件A2与脂质的结合增加了清晰频率变化所见的质量，但不会干扰二层结构，如耗散的唯一小变化所示。

当钙离子被溷合剂（EGTA）去除时，附件A2与脂质膜分离。频率和耗散记录转移到与双层显示的水平只表示附件A2结合是完全取决于钙离子和脂质膜保持不变。此处显示了一个具有代表性的负对控制实验。

当磷酸盐缺乏时，在钙离子存在的情况下添加附件A2后，频率或耗散没有明显变化。在尝试此过程时，确保正确的双层形成非常重要。立即使用脂质体，否则小囊泡会融合成较大的囊泡，表面张力较小，可能导致基线不稳定。

按照这个程序，可以执行膜蛋白相互作用的定量描述，以回答其他问题，如合作与非合作结合。