我们的方法有助于研究蛋白质复合物的形成动力学。它描述了蛋白质复合物有多紧，以及蛋白质复合物是否受到其他蛋白质的干扰。该技术能够以荧光为报告，以定量方式研究蛋白质-蛋白质相互作用，我们的测定可以实时监测蛋白质复合物的关联与分离。
首先，从蛋白质数据库中的 COL1 CAND1 复合物数据开始设计 FRET 检测。加载 PyMOL 中的结构，然后转到向导菜单并使用测量功能估计 CAND1 的第一个氨基酸与 COL1 的第一个氨基酸之间的距离。然后，加载在线光谱查看器，并同时查看7-氨基-4-甲基二甲酸酯和FlASH的激发和发射光谱。
Amc 是 Fret 的捐赠者， Flash 是 Fret 的接受者。在随附的文本协议中遵循 FRET 供体蛋白，准备细胞。然后，首先在表达COL1分理RBX1复合物的E.Coli细胞颗粒中加入50毫升的解解缓冲液，从而净化COL1分理RBX1复合物。
将冰上的细胞以50%的振幅进行声波化。将电源交替三分钟，使电源打开一秒，然后关闭一秒，以防止样品过热。将产生的细胞回转物到50毫升离心管中，以25，000倍g离心去除细胞碎屑45分钟。
然后，将上清液加入五毫升谷胱甘肽珠，并在摄氏四度时孵育，以清除细胞。孵育后，将珠子以1，500倍g的分离混合物离心，在4摄氏度下两分钟。然后，取出上一液。
接下来，用5毫升的解液缓冲液洗珠，没有蛋白酶抑制剂。离心溶液后，取出上经剂。现在，在洗涤的珠子上加入三毫升的解液缓冲液，并将珠浆转移到空柱中。
到新列，还要添加五毫升的洗脱缓冲液，然后孵育该柱 10 分钟并收集洗脱液。接下来，从谷胱甘肽珠中加入200微升的血栓，每毫升5毫克。在四摄氏度下过夜孵育后，用缓冲液 A 稀释蛋白质样品三倍，将蛋白质样本加载到缓冲液 A 平衡的阳离子交换色谱柱中，每分钟零点五毫升。
然后，在缓冲液 A 中添加 0 至 50% 的缓冲液 B 梯度，以每分钟 1 毫升的流速对蛋白质进行分流。接下来，将含有F FRET供体蛋白的埃卢酸盐分数集中，并使用具有30千吨截止量的超滤膜将水分浓缩到2点5毫升。现在，通过分理中分理转位将7-氨基-4-甲基二甲酸酯加入COL1的c-端，首先使用脱盐柱将F FRET供体蛋白样本中的缓冲液更换到分理缓冲液中。
为此，首先使用 25 毫升的排序酶缓冲液平衡脱盐柱。然后，将两点五毫升的FLET供体蛋白溶液装入柱中，丢弃流经。接下来，用三点五毫升的分子缓冲液对样品进行采样，然后收集流。
在900微升的伊卢酸盐中，加入100微升600微摩尔纯化分子A溶液和10微升25毫摩尔GG-AMC肽。在黑暗中过夜，在30摄氏度下孵育反应混合物，产生COL1-AMC-RBX1。现在，将所有样品加载到大小排除色谱列上，用一点五倍于缓冲器的柱体积来填充它。
最后，将包含 COL1-AMC-RBX1 的分水分数池化。在文本协议中遵循，准备F FRET接受蛋白。许多步骤类似于F FRET供体蛋白制剂。
完成后，准备 FlASH CAND1 解决方案。首先，在新鲜准备的四囊-CAND1 解决方案的 50 微升中添加一个 FlASH 解决方案的微升。将组合溶液混合好，在黑暗中室温下孵育混合物一至两个小时，形成FlASH CAND1溶液。
在 300 微升的 FRET 缓冲液中，将 COL1-AMC-RBX1 添加到 70 纳米摩尔的最终浓度中，并将溶液转移到一个库子中。将蛋黄酱放在荧光计的样品架中。使用 350 纳米激励光激发样品，以一纳米的增量扫描 400 到 600 纳米的发射信号。
然后，在300微升的FLET缓冲液中，将COL1-AMC-RBX1和FlASH-CAND1添加到70纳米摩尔的最终浓度中。使用 350 纳米激励光激发样品，以一纳米的增量扫描 400-600 纳米的发射信号。将激励光设置为 350 纳米，并使用带通滤波器，允许 450 纳米发射光通过并阻挡 500 到 650 纳米发射光。
样品阀处于灌装位置，连接充满水的三毫升注射器。然后，通过多次移动样品注射器驱动器，将两个样品注射器水洗净，完成后丢弃水。接下来，连接一个装满F FRET缓冲液的三毫升注射器。
使用 FRET 缓冲液清洗两个样品注射器，通过上下移动样品注射器驱动器几次，完成后丢弃水。现在，连接一个三毫升注射器，并加载第一个样品注射器，注射器 A，与100纳米摩尔COL1-AMC-RBX1在FLET缓冲液。然后将样品阀转向驱动位置 此外，将三毫升注射器连接到注射器 B，并在 FRET 缓冲液中用 100 纳米的 FlASH CAND1 将注射器 B 加载，然后将其阀转向驱动位置。
打开软件中获取的控制面板，并在 60 秒内记录 COL1-AMC 的发射。然后，只打一枪。将减少和荧光信号从每次拍摄测量到单个指数曲线。
如上所示，将系统清洗，然后在 FRET 缓冲液中添加 100 纳米摩尔 COL1-AMC-RBX1 和 100 纳米摩尔 FlASH CAND1 溶液，将其连接到注射器 A.将其连接到系统，而它处于填充位置，加载注射器 A，然后将样品阀转向驱动位置。接下来，将 Skp1-Skp2 溶液加载到注射器 B.将其连接到系统，而系统处于填充位置。装装注射器 B，然后将样品转向驱动位置。
在软件中，转到获取并打开控制面板。设置程序以记录 COL1-AMC 在 30 秒内的排放。那就打一针吧
当从注射器 A 和注射器 B 混合溶液后，荧光信号会随着时间的推移而增加。 当 70 纳米摩尔混合在一起生成 FRET 时，发射光谱中存在两个发射峰值。COL1-AMC的峰值变低，FlASH CAND1的峰值变高。当全长 CAND1 用于 FRET 时，捐赠者峰值的强度降低 10%。
然而，当第一个螺旋截断的 CAND1 使用时，捐赠者峰值强度的降低增加到 30%，这意味着 FRET 效率更高为了确认信号变化是由 COL1-AMC 和 FlASH CAND1 之间的 FRET 导致的，捐赠者 FRET 与多余未带标签的 CAND1 混合在一起，称为接受器中的大通。结果，捐赠峰完全恢复，接受峰减少。此处显示的是线性回归分析后，使用 CAND1 浓度的平均观测 K 值的绘图。
为了测量复合物的常数，在一系列观测到的分离率常数中，通过混合50纳米摩尔COL1-AMC与增加的FlASH CAND1浓度来测量。与对常数的测量类似，通过监测停止流量荧光仪上供体信号的恢复情况，发现了 COL1 和 CAND1 的观测分离常数。在这里，供体信号迅速增加，它揭示了观测到的K值为零点/秒四。
相比之下，当缓冲液被添加到预组装的复合物时，没有观察到信号增加，这表明COL1 CAND1的快速分离是由Skp1 Skp2触发的。尽量把荧光团留在黑暗中。
