利用南方印迹和聚合酶链反应鉴定小鼠胚胎干细胞的同源重组事件

该方法有助于回答分子和细胞生物学领域的关键问题，如识别小鼠胚胎干细胞中的同源重组事件。该技术的主要优点是准确、可靠、应用广泛。因此，该方法可以深入了解小鼠胚胎干细胞中的同源重组事件。

它也可以应用于其他系统，如转基因细胞或动物。通常，对此方法的个别新用户将难以操作，因为它需要很长时间并涉及多个步骤。对于每个 gDNA，混合 30 微升 10 x 缓冲液，用于 DRA 一个，3 微升 DRA 1 和 10 微克 gDNA。

加入水，直到最终体积为30微升，并在37摄氏度孵育过夜消化gDNA。用溴化乙基准备1%的阿加罗斯电泳凝胶。将以前采集的样品以及一个 KB 梯子装载到凝胶上，并在一夜之间以 30 到 40 伏运行。

第二天，将凝胶浸泡在含有0.2牛顿盐酸溶液的托盘中。在室温下，使用摇床轻轻摇动托盘 20 分钟。将凝胶转移到含有DNA变性溶液的托盘上。

在室温下轻轻摇动20分钟。然后将凝胶转移到含有脱氧核糖核酸中和溶液的托盘中。在室温下轻轻摇动20分钟。

使用快速向下传输系统，将DNA从凝胶转移到膜。接下来，按照制造商提供的说明中概述的，组装涡轮和印迹堆栈。之后，拿出膜，用两个X盐水柠檬酸钠洗涤一分钟。

用组织吸收液体，然后使用UV交联器将DNA与膜交叉连接。要开始用放射性标记DNA探针，请将热变性探针DNA添加到含有随时可去DNA标记珠的管中。移液向上和向下混合。

并添加五微升放射性标记脱氧核糖二苯二甲酸酯。在37摄氏度下孵育15分钟。根据制造商提供的说明，使用 G 50 微柱对标记探头进行净化。

使用闪烁计数器测量放射性。要开始将膜与标记探头混合，请将膜放入杂交管中。添加混合预杂交解决方案。

将管子放入杂交炉中，让预杂交在42摄氏度下进行30分钟。然后，从烤箱中取出管子，将预杂交溶液倒入 50 毫升管中。加入变性探头，轻轻混合。

要去除非杂交探头，请将膜放入含有一个 X 盐水柠檬酸钠的托盘中，并在 55 至 60 摄氏度下轻轻摇动 10 分钟。在此之后，用塑料包装膜，并将其固定在曝光盒中。在黑暗的房间里，将膜暴露在两片 X 射线膜上。

开发胶片以可视化结果。根据探测器检测到的DNA波段的大小，确定相应的ES克隆是否为具有重组目标的所需克隆。在这项研究中，利用南方印迹和PCR来识别小鼠ES细胞中发生的HR事件，以便使用基于ES细胞的基于HR的定位技术生成NM两个遗传替代小鼠模型。

由于基因组DNA被切成许多不同长度的片段，它们在DNA凝胶上显示一种像涂片一样的状态。这表明基因组DNA的完全消化。作为南方印迹的最后一步，在胶片上显示标有探针的放射性信号与目标DNA片段混合。

预期波段的出现反映了 ES 克隆中 HR 事件的发生。根据研究中的预设计，具有变异等位基因的ES克隆具有两个不同的大小带。虽然野生类型 ES 克隆只有一个波段，但表明所需的 ES 克隆是异质克隆。

在PCR反应之后，PCR产品可以在DNA凝胶上进行分析。如果观察到正确大小的特定 NPCR 波段，则建议发生 HR 事件，可以通过对 PCR 频段进行测序来进一步确认。由于基础相同，该技术的含义扩展到识别点突变的疗法。

尝试这个程序是重要的记住要有耐心和小心。按照这个程序，可以执行其他方法，如ES细胞的微注射到囊肿，以回答额外的问题，如有形成嵌合动物。随着技术的发展，这项技术为分子和细胞生物学领域的研究人员探索特定基因的功能或小鼠或外基因突变的结果铺平了道路。

不要忘记，使用放射性标签 P32 DCTB 可能非常危险，执行此过程时应始终采取预防措施，例如使用保护板进行屏蔽。