Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia molecular e celular, como identificar eventos de recombinação homólogos em células-tronco embrionárias de camundongos. A principal vantagem desta técnica é que ela é precisa, confiável e amplamente utilizada. Assim, este método pode fornecer informações sobre a identificação de eventos de recombinação homólogos em célula-tronco embrionária do rato.
Também pode ser aplicado a outros sistemas, como células geneticamente modificadas ou animais. Geralmente, o novo indivíduo neste método vai lutar porque leva muito tempo e envolve múltiplos passos. Para cada gDNA, misture 30 microlitadores de 10 x buffer para DRA um, três microliters de DRA um e 10 microgramas de gDNAs por amostra.
Adicione água até que o volume final seja de 30 microlitadores, e incubar a 37 graus celsius durante a noite para digerir os gDNAs. Prepare um gel de eletroforese de 1%agarose com brometo de ethidium. Carregue as amostras adquiridas anteriormente junto com uma escada KB de um KB no gel, e execute-as a 30 a 40 volts durante a noite.
No dia seguinte, mergulhe o gel em uma bandeja contendo uma solução de ácido clorídrico newton 0,2. Use um agitador para agitar a bandeja suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente. Transfira o gel para uma bandeja contendo uma solução de desnaturação de DNA.
Agite suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira o gel para uma bandeja contendo uma solução de neutralização de DNA. E agite suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente.
Usando um sistema de transferência descendente rápido, transfira os DNAs do gel para a membrana. Em seguida, monte a mancha turva e a pilha de manchas, conforme descrito nas instruções fornecidas pelo fabricante. Depois disso, tire a membrana e lave-a com duas citratos de sódio salino X por um minuto.
Absorva o líquido com tecidos, e então use um crosslinker UV para cruzar o DNA com a membrana. Para começar a rotular as sondas de DNA com radioatividade, adicione o calor desnaturado DNAs sonda ao tubo contendo as contas prontas para a rotulagem de DNA. Pipeta para cima e para baixo para misturar.
E adicione cinco microliters de triphosfato de deoxicytodine radioativamente rotulado. Incubar a 37 graus celsius por 15 minutos. Purifique os testes rotulados usando colunas G 50 micro de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
Use um contador de cintilação para medir a radioatividade. Para começar a hibridizar as membranas com as sondas rotuladas, coloque a membrana no tubo de hibridização. Adicione a solução mista de pré-hibridização.
Coloque o tubo no forno de hibridização e deixe a pré-hibridização prosseguir a 42 graus celsius por 30 minutos. Em seguida, retire o tubo do forno e despeje a solução de pré-hibridização em um tubo de 50 mililitros. Adicione a sonda desnaturada e misture delicadamente.
Para remover as sondas não hibridizadas, coloque a membrana em uma bandeja contendo uma citrato de sódio salino X com SDS de 0,1% e agite suavemente a 55 a 60 graus celsius por 10 minutos. Depois disso, enrole a membrana com plástico e fixe-a no de exposição. Em uma sala escura, exponha a membrana a duas folhas de filme de raio-X.
Desenvolva o filme para visualizar os resultados. Determine se um clone ES correspondente é o desejado com o alvo de recombinação ou não, de acordo com os tamanhos das bandas de DNA detectadas pelas sondas. Neste estudo, a mancha do sul e o PCR são utilizados para identificar eventos de RH que ocorrem em células ES de camundongos para a geração de NM dois modelos de camundongos de substituição genética usando a tecnologia de segmentação mediada por RH baseado em células ES.
Como os DNAs genômicos são cortados em muitos fragmentos com diferentes comprimentos, eles exibem uma mancha como status no gel de DNA. Isso sugere uma digestão completa dos DNAs genômicos. Como um passo final de mancha sul, os sinais de uma sonda rotulada por radioatividade hibridização com um fragmento de DNA alvo são mostrados no filme.
O aparecimento de bandas esperadas reflete a ocorrência de eventos de RH nos clones do ES. De acordo com o pré-sinal do estudo, os clones ES com alelo mutado têm duas faixas de tamanho distintas. Enquanto os clones do tipo selvagem ES têm apenas uma banda, sugerindo que os clones ES desejados são heterozigosos.
Após a reação do PCR, os produtos PCR podem ser analisados no gel de DNA. Se uma banda NPCR específica do tamanho correto for observada, isso sugere a ocorrência de eventos de RH que podem ser confirmados ainda mais pelo sequenciamento dessa banda PCR. A implicação dessa técnica se estendeu à terapia de identificação de mutação de ponto porque a fundação é idêntica.
Ao tentar este procedimento é importante lembrar de ser paciente e cuidadoso. Após esse procedimento, outro método como a microinjeção de células ES em blastocistos pode ser realizado a fim de responder a perguntas adicionais como a formação de animais quiméricos. Ao alto de seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador em seu campo de biologia molecular e celular explorar a função de um gene específico ou a consequência de um gene mutante em camundongos ou além.
Não se esqueça que trabalhar com o etiquetador de radioatividade P32 DCTB pode ser extremamente perigoso e precauções como blindagem com placa de proteção devem estar sempre tomando durante a realização deste procedimento.
