Bu yöntem, fare embriyonik kök hücrelerinde homolog rekombinasyon olaylarının belirlenmesi gibi moleküler ve hücresel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı doğru, güvenilir ve yaygın olarak kullanılmasıdır. Yani, bu yöntem fare embriyonik kök hücre homolog rekombinasyon olayları belirlenmesi içine fikir sağlayabilir.
Ayrıca genetiği değiştirilmiş hücre veya hayvanlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genellikle, bu yönteme yeni bireysel uzun zaman alır ve birden çok adım içerir, çünkü mücadele edecek. Her gDNA için DRA bir için 10 x tamponun 30 mikrolitresini, üç mikrolitre DRA bir ve numune başına 10 mikrogram gDNA'yı karıştırın.
Son hacmi 30 mikrolitre olana kadar su ekleyin ve gDNA'ları sindirmek için bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ethidyum bromür ile %1 agarose elektroforez jeli hazırlayın. Jel üzerine bir KB merdiven ile birlikte daha önce elde edilen örnekleri yükleyin ve bir gecede 30 ila 40 volt çalıştırın.
Ertesi gün, 0.2 newton hidroklorik asit çözeltisi içeren bir tepside jel ıslatın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca tepsiyi hafifçe sallamak için bir çalkalayıcı kullanın. Jeli DNA denatüre solüsyonu içeren bir tepsiye aktarın.
Oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe sallayın. Daha sonra jeli DNA nötralize edici çözelti içeren bir tepsiye aktarın. Ve oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe sallayın.
Hızlı bir aşağı aktarım sistemi kullanarak, jelden membrana dNA aktarın. Daha sonra, üretici tarafından sağlanan talimatlarda belirtildiği gibi türme leke ve leke yığınımonte. Bundan sonra, membran çıkarmak ve bir dakika boyunca iki X tuzlu sodyum sitrat ile yıkayın.
Dokular ile sıvı absorbe ve sonra membran ile DNA çapraz bağlantı için bir UV crosslinker kullanın. DNA sondalarını radyoaktivite ile etiketlemeye başlamak için, ısı denatüre probu DNA'larını, dna etiketleme boncukları etiketlemeye hazır olan tüpüiçeren tüpe ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.
Ve radyoaktif olarak etiketlenmiş beş mikrolitre deoksisitonin trifosfat ekleyin. 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yat. Üretici tarafından sağlanan talimatlara göre G 50 mikro sütunlar kullanarak etiketli probları arındırın.
Radyoaktiviteyi ölçmek için bir ışıltı sayacı kullanın. Membranları etiketli problarla melezleştirmeye başlamak için membranı hibridizasyon tüpüne yerleştirin. Karışık ön hibridizasyon çözümlerini ekleyin.
Tüpü hibridizasyon fırınına yerleştirin ve ön hibridizasyonun 42 derecede 30 dakika boyunca devam edin. Daha sonra, fırından tüp çıkarın ve 50 mililitrelik tüp içine ön hibridizasyon çözeltisi dökün. Denatüre probu ekleyin ve yavaşça karıştırın.
Melezleştirilmeyen probları çıkarmak için membranı %0,1 SDS ile bir Adet X tuzlu sodyum sitrat içeren bir tepsiye yerleştirin ve 10 dakika boyunca 55 ila 60 derecede hafifçe sallayın. Bundan sonra, plastik şal ile membran sarın ve pozlama kaseti düzeltmek. Karanlık bir odada, x ışını film iki yaprak membran maruz.
Sonuçları görselleştirmek için filmi geliştirin. Problar tarafından tespit edilen DNA bantlarının boyutlarına göre, rekombinasyon hedefiyle birlikte istenilen ES klonu olup olmadığını belirleyin. Bu çalışmada, Es hücreleri tabanlı İk aracılı hedefleme teknolojisini kullanarak NM iki genetik yedek fare modeli nin üretimi için fare ES hücrelerinde meydana gelen İk olaylarını tanımlamak için güney lekeleme ve PCR kullanılmıştır.
Genomik DNA'lar farklı uzunluklarda birçok parçaya bölündeler, DNA jelinde benzer bir yayma gösterirler. Bu genomik DNA'ların tam bir sindirim ini önerir. Güney lekelemenin son adımı olarak, bir radyoaktivitenin sinyallerini hedef DNA parçasıyla melezleyen sonda olarak etiketlenmiş olarak filmde gösterilmiştir.
Beklenen bantların görünümü ES klonları İk olaylarının oluşumunu yansıtır. Çalışmada ön tasarıma göre, mutasyona uğramış alel ile ES klonlar iki farklı boyut bantları var. Yabani tip ES klonların sadece bir bantları olsa da, istenilen ES klonları heterozigot olduğunu düşündürmektedir.
PCR reaksiyonu sonrasında, PCR ürünleri DNA jeli üzerinde analiz edilebilir. Doğru boyutta belirli bir NPCR bandı gözlenirse, bu durum, pcr bandının sıralanmasıyla daha da doğrulanabilecek İk olaylarının meydana geldiğini gösterir. Bu tekniğin anlamı, temeli aynı olduğu için nokta mutasyonunun tanımlanması tedavisine kadar uzanmıştır.
Bu prosedürü çalışırken sabırlı ve dikkatli olmak hatırlamak önemlidir. Bu işlemden sonra, es hücresinin blastosistlere mikroenjeksiyonu gibi başka bir yöntem de şimerik hayvanların oluşumu gibi ek bir soruya cevap vermek için yapılabilir. Bu teknik, moleküler ve hücresel biyoloji alanında araştırmacının belirli bir genin işlevini veya farelerde veya ötesinde mutasyona uğramış bir genin sonucunu keşfetmesinin önünü açtı.
Radyoaktivite etiketleyicisi P32 DCTB ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve koruma panosu ile koruma tahtası ile koruma gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
