Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular y celular, como la identificación de eventos de recombinación homóloba en células madre embrionarias de ratón. La principal ventaja de esta técnica es que es precisa, fiable y ampliamente utilizada. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la identificación de eventos de recombinación homóloba en células madre embrionarias de ratón.
También se puede aplicar a otros sistemas, como células modificadas genéticamente o animales. Generalmente, lo nuevo individual en este método tendrá problemas porque toma mucho tiempo e implica varios pasos. Para cada gDNA, mezcle 30 microlitros de 10 x tampón para DRA uno, tres microlitros de DRA uno y 10 microgramos de gDNAs por muestra.
Agregue agua hasta que el volumen final sea de 30 microlitros, e incubar a 37 grados centígrados durante la noche para digerir los gDNAs. Preparar un gel de electroforesis de 1% de agarosa con bromuro de etidio. Cargue las muestras adquiridas previamente junto con una escalera de un KB en el gel y ejecútela a 30 a 40 voltios durante la noche.
Al día siguiente, remoje el gel en una bandeja que contenga una solución de ácido clorhídrico de 0,2 newton. Use una coctelera para agitar suavemente la bandeja durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transfiera el gel a una bandeja que contenga una solución de desnaturalamiento del ADN.
Agitar suavemente durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el gel a una bandeja que contenga una solución neutralizante del ADN. Y agítalo suavemente durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Usando un sistema de transferencia rápida hacia abajo, transfiera los DNAs del gel a la membrana. A continuación, montar la hinchazón y la pila de hinchazón como se describe en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Después de esto, sacar la membrana y lavarla con dos citrato de sodio salino X durante un minuto.
Absorber el líquido con tejidos, y luego utilizar un reticulante UV para cruzar vincular el ADN con la membrana. Para comenzar a etiquetar las sondas de ADN con radiactividad, agregue la sonda desnaturalada por calor DNA al tubo que contiene las perlas de etiquetado de ADN listas para ir. Pipetear arriba y abajo para mezclar.
Y añadir cinco microlitros de trifosfato de desoxitodina radioactivamente etiquetado. Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Purifique las sondas etiquetadas utilizando micro columnas G 50 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Utilice un contador de centelleo para medir la radiactividad. Para comenzar a hibridar las membranas con las sondas etiquetadas, coloque la membrana en el tubo de hibridación. Agregue la solución de pre hibridación mixta.
Coloque el tubo en el horno de hibridación y deje que la pre hibridación proceda a 42 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, retire el tubo del horno y vierta la solución de pre hibridación en un tubo de 50 mililitros. Agregue la sonda desnaturalizado y mezcle suavemente.
Para extraer las sondas no hibridas, coloque la membrana en una bandeja que contenga un citrato de sodio salino X con 0,1%SDS y agite suavemente a 55 a 60 grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, envuelva la membrana con una envoltura de plástico y fíjela en el cassette de exposición. En una habitación oscura, exponga la membrana a dos hojas de película de rayos X.
Desarrollar la película para visualizar los resultados. Determinar si un clon ES correspondiente es el deseado con el objetivo de recombinación o no, de acuerdo con los tamaños de las bandas de ADN detectadas por las sondas. En este estudio, la hinchazón del sur y la PCR se utilizan para identificar los eventos de RRHH que se producen en las células ES del ratón para la generación de dos modelos de ratón de reemplazo genético DE NM utilizando la tecnología de focalización mediada por HR basada en células ES.
Debido a que los ADN genómicos se cortan en muchos fragmentos con diferentes longitudes, muestran un frotis como el estado en el gel de ADN. Esto sugiere una digestión completa de los ADN genómicos. Como último paso de la hinchazón del sur, las señales de una sonda etiquetada por radiactividad hibridando con un fragmento de ADN objetivo se muestran en la película.
La aparición de bandas esperadas refleja la ocurrencia de eventos de RRHH en los clones DE. Según el prediseño en el estudio, los clones ES con alelo mutado tienen dos bandas de tamaño distinto. Mientras que los clones ES de tipo salvaje sólo tienen una banda, lo que sugiere que los clones ES deseados son heterocigotos.
Después de la reacción pcR, los productos PCR se pueden analizar en el gel de ADN. Si se observa una banda NPCR específica del tamaño correcto, esto sugiere la ocurrencia de eventos de RRHH que pueden ser confirmados aún más por la secuenciación de esa banda PCR. La implicación de esta técnica se extendió a la terapia de identificación de la mutación puntual porque la base es idéntica.
Al intentar este procedimiento es importante recordar ser paciente y cuidadoso. Después de este procedimiento, se puede realizar otro método como la microinyección de la célula ES en blastocistos con el fin de responder a preguntas adicionales como la formación de animales quiméricos. Aft su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que el investigador en su campo de la biología molecular y celular explorara la función de un gen específico o la consecuencia de un gen mutado en ratones o más allá.
No olvide que trabajar con el etiquetador de radiactividad P32 DCTB puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como el blindaje con la placa de protección siempre deben estar tomando mientras se realiza este procedimiento.
