拟南芥叶绿体子隔层的制备及免疫印迹蛋白质组化分析

该技术的主要优点是，它允许区分具有不同作用的类似活动的蛋白质，这取决于包络、频闪膜或胸腺膜的定位。一般来说，对这种方法的新鲜人会很挣扎，因为他们会使用太旧的植物，混合叶子太久，或者在重新悬浮完整但脆弱的叶绿体颗粒时不够小心。此方法的可视化演示至关重要，因为很难学习从 percoll 或蔗糖梯度步骤中加载或恢复分数。

由于梯度的混合的风险，从而交叉污染各种叶绿素子。演示程序将由伊门·布奇纳克，一个博士生从我们的实验室和卢卡斯莫耶特，室内工程师。首先，种植阿拉伯植物五周，白天23摄氏度，夜间18摄氏度，光度为150微摩尔/秒。

第二天，预先称一个五升烧杯，然后放在冰上。收获阿拉伯叶子，确保避免采摘任何土壤。重新称量烧杯并记录组织重量。

将收获的叶子转移到寒冷的房间。将叶子放在装有两升研磨缓冲液的搅拌机中，通过高速混合三次，每次两秒钟，使叶子均匀。将四层粘液和一层尼龙蓝色纹克斯放入过滤器中，用于过滤均质。

轻轻挤压混在粘液和蓝色纹克斯内的混合叶子，以提取所有液体。回收搅拌杯中的剩余组织，并使用新鲜的研磨缓冲液重复均质化过程。使用四到五层新粘液在新型烧杯中过滤这种新的同质质，如前所述。

将粗细胞提取物平均分配到六个500毫升的瓶子中。把瓶子放在冰上。将冷却瓶在2070 G和4摄氏度下离心两分钟。

在此之后，轻轻丢弃上经剂。使用水泵吸气任何剩余的上能物，并保留含有浓缩粗叶绿体颗粒的颗粒在冰上。使用 10 毫升移液器，向每个瓶子添加 3 毫升的洗涤介质，确保不要使用精细移液器提示以避免破坏叶绿体。

然后，使用油漆刷或弯曲的塑料铲轻轻重新悬浮颗粒。使用 10 毫升移液器，在单个管中收集重新悬浮的叶绿体。轻轻反转管子，获得均匀的叶绿体悬浮液。

首先，使用 10 毫度移液器，在六个准备好的 percoll 梯度上缓慢加载 6 毫升的叶绿体悬浮液。使用摆动铲斗转子，在 13，300 G 和 4 摄氏度下将梯度离心 10 分钟。使用水泵吸气上相，其中含有破碎的叶绿体和完整的线粒体。

然后，使用10毫升移液器取回下相中存在的完好的叶绿体，小心不要吸气管底部的核和细胞碎片以及完好的叶绿体。用洗涤介质稀释完好的叶绿体悬浮液三到四倍。保留约 10 毫升的等分叶体，供 SDS-Page 和西方印迹进一步分析。

在2070 G和4摄氏度下离心两分钟。在此之后，轻轻丢弃上经剂。使用水泵吸气任何剩余的上能物，并保留含有浓缩粗叶绿体的颗粒在冰上。

要对纯化的完好叶绿体进行精制，在含有蛋白酶抑制剂的低质介质中重新悬浮颗粒。将重新悬浮的叶绿体转移到10毫升猎鹰管中。准备文本协议中概述的蔗糖梯度。

使用近光泵，缓慢地将三毫升的乳解叶绿体加载到每个预制蔗糖梯度的顶部。使用低度介质缓冲器平衡管对，然后在7万G和4摄氏度的梯度超离心一小时。以可溶性频闪蛋白的等分，用于确定蛋白质浓度。

接下来，使用水泵将梯度的剩余上部阶段吸入到黄色带。使用移液器，检索黄色带，即信封。将信封拉成一根管子。

然后，将梯度的剩余相切到胸腺颗粒。使用蛋白酶抑制剂在膜洗涤缓冲液中重新悬浮胸腺颗粒。用洗涤介质稀释胸腺素悬浮液和包络三到四倍，将最终体积调整为10毫升。

平衡管对与膜洗涤缓冲液和超离心机他们在11万G和4摄氏度一个小时。之后，使用水泵小心吸上经。在信封颗粒中加入约100微升膜洗涤缓冲液。

然后，从胸腺管中吸出上一提液。将胸腺颗粒重新悬浮在三毫升膜洗涤缓冲液中。将三个净化亚室储存在液氮中，用于进一步实验。

在回收、洗涤和浓缩膜分数后，SDS-Page 用于量化蛋白质并分析所有四个分数的组成。频闪中最丰富的蛋白质是RBCL，具有代表性的结果表明，这种蛋白质的大亚单位中，很少含有胸腺和包膜分数。光收集复合蛋白是丰富的胸腺素成分，几乎不能污染包络膜。

最后，磷酸盐三叶磷酸盐转位器仅在纯化的包络分数中可见，因为与整个叶绿体提取物相比，其在包络分数中具有很强的富集性。三个子腔的交叉污染，可溶性酮酸还原异构酶从频闪，叶绿素包络铜APase，以及光收获复杂的蛋白质从胸腺膜可以通过使用免疫印迹和质谱分析进行量化。虽然频闪通常不被包络或胸腺素分数污染，但纯化的包络分数含有3%的胸腺蛋白和高达10%的频闪蛋白。

胸腺素被频闪的蛋白质污染不良，但含有高达3%的包膜蛋白。叶绿体具有许多关键功能，如碳、硫和氮的同化，以及基本代谢物的合成。为了破译控制叶绿体生理学的新调控机制，确定叶绿体蛋白的质质定位对于超靶向研究至关重要。

叶绿体包含多个子节。此方法可以帮助回答叶绿体领域中的关键问题，例如特定的叶绿蛋白位于细胞器内的位置。在尝试此程序时，重要的是要记住在四度下执行所有叶绿体分离步骤，将蛋白酶电阻汇入纯化分数中。

按照此过程，可以执行其他方法，如拉斯卡雷蛋白质组方法，以回答其他问题，如值的蛋白质组组成和动态的质阶子节。该技术开发后，为植物生理学领域的研究人员利用对在鸭嘴兽亚室中识别的候选蛋白质的靶向分析，探索叶绿体生物生成和功能的许多不同方面铺平了道路。不要忘记，使用体积搅拌机，液氮，在蛋白酶抑制剂等特定化合物上工作，需要特别小心。

执行此过程时，应始终采取戴手套、实验室外套和安全眼镜等预防措施。