היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להבחין בין חלבונים של פעילויות דומות שיש להם תפקידים שונים, בהתאם לוקליזציה במעטפה, סטרומה, או ממברנות תילאקואיד. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו, כי הם ישתמשו בצמחים ישנים מדי, למזג את העלה במשך זמן רב מדי, או לא יהיה זהיר מספיק כאשר להשעות מחדש את כדורי שלם, אבל שביר, כלורופלסט. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו טעינה או שחזור של שבר פרקול או בשלבים הדרגתיים סוכרוז קשה ללמוד.
בגלל הסיכון של מיזוג של מעברי צבע ובכך של זיהום צולב של שברי משנה כלורופלסט שונים. הדגמת ההליך תהיה על ידי אימן Bouchnak, דוקטורנט מהמעבדה שלנו ולוקאס מוייט, מהנדס מקורה. כדי להתחיל, לגדל צמחים arabidopsis במשך חמישה שבועות עם מחזור אור 12 שעות ב 23 מעלות צלזיוס ביום ו 18 מעלות צלזיוס בלילה, עם עוצמת אור של 150 micromoler למ"ר לשנייה.
למחרת, לשקול מראש מקור חמישה ליטר ולאחר מכן למקם אותו על קרח. לקצור את עלי arabidopsis, הקפדה להימנע לקטוף כל אדמה. לשקול מחדש את הסקילר ולתקליט את משקל הרקמה.
מעבירים את העלים שנקטפו לחדר קר. מניחים את העלים בבלנדר המכיל שני ליטרים של חיץ שחיקה ומערבבים אותם על ידי מיזוג במהירות גבוהה שלוש פעמים למשך שתי שניות בכל פעם. מניחים ארבע שכבות של מוסלין ושכבה אחת של טקס כחול ניילון לתוך מסננת וזה כדי לסנן את הומוגנטי.
לסחוט בעדינות את העלים הממוזגים בתוך muslin וטקס כחול כדי לחלץ את כל הנוזל. לשחזר את הרקמה הנותרת ב בלנדר ולחזור על תהליך הומוגניזציה באמצעות חיץ שחיקה טרי. השתמש בארבע עד חמש שכבות של מוסלין חדש כדי לסנן הומוגניט חדש זה בסק חדש כפי שתואר קודם לכן.
להפיץ את תמצית התא הגולמי באותה מידה לשישה בקבוקי 500 מיליליטר. מניחים את הבקבוקים על קרח. צנטריפוגה את הבקבוקים המצוננים ב 2070 G וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.
לאחר מכן, השלך בעדינות את העל-טבעי. השתמש במשאבת מים כדי לשאוב כל על-טבעי שנותר ולשמור את כדורי, המכילים כלורופלסט גולמי מרוכז, על קרח. באמצעות פיפטה 10 מיליליטר, להוסיף שלושה מיליליטר של מדיום כביסה לכל בקבוק, הקפד לא להשתמש טיפים פיפטה בסדר כדי למנוע שבירת chloroplasts.
לאחר מכן, השתמש במברשת צבע או מרית פלסטיק מעוקלת כדי להשעות בעדינות את כדורי. באמצעות פיפית 10 מיליליטר, לאסוף את כלורופלסטים מושעה מחדש בצינור אחד. בעדינות להפוך את הצינור כדי לקבל השעיה הומוגנית כלורופלסט.
כדי להתחיל, השתמש פיקט 10 מיליליטר לאט לטעון שישה מיליליטר של ההשעיה כלורופלסט על גבי כל אחד מששת שיפוע percoll מוכן. באמצעות רוטור דלי מתנדנד, צנטריפוגה שיפוע ב 13, 300 G ו ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השתמש במשאבת מים כדי לשאוב את השלב העליון, המכיל כלורופלסטים שבורים ומיטוכונדריה שלמה.
לאחר מכן, השתמש פיפט 10 מיליליטר כדי לאחזר chloroplasts שלם נוכח בשלב התחתון, נזהר לא לשאוף את הגרעינים ואת פסולת התא נמצא בתחתית הצינור יחד עם chloroplasts שלם. מדללים את המתלה הכלורופלסט שלם פי שלושה עד ארבעה עם מדיום כביסה. שמור כ -10 מיליליטר של aliquot של שבר כלורופלסט שלם לניתוח נוסף על ידי SDS-Page ו- Blotting המערבי.
צנטריפוגה ב 2070 G וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר מכן, השלך בעדינות את העל-טבעי. השתמש במשאבת מים כדי לשאפת כל על-טבעי שנותר ולשמור את גלולת, המכילה כלורופלסטים גולמיים מרוכזים, על קרח.
כדי לתפור את כלורופלסטים שלמים מטוהרים, להשעות מחדש את גלולה במדיום היפוטוני המכיל מעכבי פרוטאז. העבר את הכלורופלסטים המושעים מחדש לצינור בז 10 מיליליטר. הכן את מעבר הצבע של ה- Sucrose כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
באמצעות משאבה פריסטולית, לטעון לאט שלושה מיליליטר של כלורופלסטים lysed על גבי כל אחד שיפוע סוכרוז שנוצר מראש. השתמש במאגר בינוני היפוטוני כדי לאזן זוגות של צינורות, ולאחר מכן אולטרה צנטריפוגה שיפוע ב 70, 000 G ו ארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. קח aliquot של חלבונים סטרומה מסיסים לשמש בקביעת ריכוז החלבון.
לאחר מכן, השתמש במשאבת מים כדי לשאוב את השלב העליון הנותר של המילוי ההדרגתי עד לרצועה הצהובה. באמצעות פיפטה, לאחזר את הלהקה הצהובה, שהיא המעטפה. משוך את המעטפות לתוך צינור אחד.
לאחר מכן, להסיר את השלב הנותר של השיפוע עד גלולת thylakoid. להשעות מחדש את כדורי thylakoid במאגר שטיפת קרום עם מעכבי פרוטאז. מדללים את ההשעיה התילקואידית ומעטפה פי שלושה עד ארבעה עם מדיום כביסה, מכווננים את הנפח הסופי ל-10 מיליליטר.
איזון זוגות של צינורות עם חיץ שטיפת קרום אולטרה צנטריפוגה אותם ב 110, 000 G ו ארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, השתמש במשאבת מים כדי לשאוב בזהירות את העל-טבעי. הוסיפו כ-100 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת קרום לכדור המעטפה.
לאחר מכן, שאף את העל-טבעי מצינור התילקואיד. להשעות מחדש את כדורי thylakoid בשלושה מיליליטר של חיץ שטיפת קרום. אחסן את שלושת תתי התאים המטוהרים בחנקן נוזלי לשימוש בניסויים נוספים.
לאחר שברי הממברנה הם התאוששו, שטף, ומרוכז, SDS-Page משמש לכמת את החלבונים ולנתח את ההרכב של כל ארבעת החלקים. החלבון הנפוץ ביותר מהסטרומה הוא RBCL, ותוצאות מייצגות מראות את התוצאה הצפויה, כי מעט מאוד של תת-אחת גדולה של חלבון זה מכיל את שברי התילקואידים ואת הממברנה מעטפה. החלבונים המורכבים לקצירת האור הם רכיבים תילקיים בשפע שבקושי אמורים לזהם את קרום המעטפה.
לבסוף, טרנסלוקטור פוספט טריוז פוספט גלוי רק בשבר המעטפה המטוהרת, בשל העשרתו החזקה בשבר המעטפה בהשוואה לכל תמציות הכלורופלסט. זיהום צולב של שלושת תתי התאים, צמצומים חומצת קטול מסיסים מן סטרומה, ATPase נחושת מעטפת כלורופלסט, ואת אור קצירת חלבונים מורכבים מן הממברנות תילקואיד ניתן לכמת באמצעות ניתוח immunoblotting ו ספקטרומטריה מסה. בעוד שהסטרומה אינה מזוהמת בדרך כלל על ידי שברי מעטפה או תילאקואיד, שברי המעטפה המטוהרים מכילים 3% חלבונים thylakoid עד 10% של חלבונים מן סטרומה.
התילאקואידים מזוהמים בצורה גרועה על ידי חלבונים מהסטרומה, אך מכילים עד 3% מחלבוני הממברנה במעטפה. כלורופלסטים מבצעים פונקציות חיוניות רבות כגון הטמעת פחמן, גופרית וחנקן, כמו גם סינתזה של מטבוליטים חיוניים. על מנת לפענח מנגנונים רגולטוריים חדשים השולטים בפיזיולוגיה של כלורופלסט, הגדרת לוקליזציה של חלבוני כלורופלסט היא קריטית למחקרים ממוקדי-על.
כלורופלסטים מכילים מספר תתי-תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדה כלורופלסט, כגון היכן חלבון כלורופלסט ספציפי ממוקם בתוך האיבר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנהל את כל שלבי הבידוד כלורופלסט בארבע מעלות כדי להעביר פרוטאה להתנגד לשברים מטוהרים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו גישות פרוטומיות של lascare על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הרכב ודינמיקה של הפרוטומה של תאי המשנה המשובצים של הערכים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה של הצמח לחקור היבטים רבים ושונים של הביוגנזה chloroplast ולתפקד באמצעות ניתוח ממוקד של חלבונים מועמדים שזוהו בתוך תת תאים משובצים. אל תשכח כי עבודה עם בלנדר נפח, חנקן נוזלי, על תרכובות ספציפיות כמו מעכבי פרוטאז, דורש טיפול מיוחד.
אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות צריכים תמיד להינקט בעת ביצוע הליך זה.
