Bu tekniğin en büyük avantajı, zarf, stroma veya thylakoid membranlarda lokalizasyona bağlı olarak, farklı rollere sahip benzer aktivitelerin proteinlerinin ayırt edilebilmektedir. Genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek, onlar çok eski bitkiler kullanacak, çok uzun süre yaprak karışımı, ya da bozulmamış pelet yeniden askıya alırken yeterince dikkatli olmayacaktır, ama kırılgan, kloroplast. Bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir, çünkü percoll'dan veya sakaroz gradyan basamaklarından kesirin yüklenmesi veya kurtarılması nı öğrenmek zordur.
Çünkü degradelerin karıştırılmariski ve böylece çeşitli kloroplast alt fraksiyonları çapraz kontamine. Prosedürü gösteren Imen Bouchnak, bizim laboratuvar ve Lucas Moyet, bir kapalı mühendis bir doktora öğrencisi tarafından olacaktır. Başlamak için, günde 23 derece santigrat ve gece 18 santigrat derece 12 saatlik ışık döngüsü ile beş hafta boyunca arabidopsis bitkileri büyümek, saniyede metrekare başına 150 mikromoler Bir ışık yoğunluğu ile.
Ertesi gün, beş litrelik bir kabı önceden tartın ve sonra buzüzerine yerleştirin. Hasat arabidopsis yaprakları, herhangi bir toprak toplama önlemek için emin olun. Kabı yeniden tartın ve doku ağırlığını kaydedin.
Hasat edilen yaprakları soğuk bir odaya aktarın. Yaprakları iki litre öğütme tamponu içeren bir blender yerleştirin ve her seferinde iki saniye süreyle yüksek hızda üç kez karıştırarak onları homojenize edin. Bir süzgeç içine muslin ve naylon mavi tex bir tabaka dört kat yerleştirin ve bu homojen filtre.
Yavaşça muslin ve mavi tex içinde sıvı tüm ayıklamak için karışık yaprakları sıkmak. Blender kabında kalan doku kurtarmak ve taze taşlama tampon kullanarak homojenizasyon işlemi tekrarlayın. Daha önce açıklandığı gibi yeni bir beher bu yeni homogenate filtrelemek için yeni muslin dört ila beş kat kullanın.
Ham hücre ekstresini altı adet 500 mililitrelik şişeye eşit olarak dağıtın. Şişeleri buza koy. Soğutulmuş şişeleri 2070 G ve dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin.
Bundan sonra, yavaşça supernatant atın. Kalan supernatant aspire ve konsantre ham kloroplast içeren pelet tutmak için bir su pompası kullanın, buz üzerinde. 10 mililitrelik pipet kullanarak, her şişeye üç mililitre yıkama ortamı ekleyin ve kloroplastları kırmamak için ince pipet uçları kullanmamaya özenli olun.
Daha sonra, peletleri yavaşça yeniden askıya almak için bir boya fırçası veya kavisli plastik spatula kullanın. 10 mililitrelik pipet kullanarak, tek bir tüpte yeniden askıda kloroplastları toplayın. Homojen kloroplast süspansiyonu elde etmek için tüpü hafifçe ters çevirin.
Başlamak için, 10 milileter pipet kullanarak altı mililitre kloroplast süspansiyonunu hazırlanan altı percoll gradyanının her birine yavaşça yükleyin. Sallanan kova rotor kullanarak, 13, 300 G ve dört derece santigrat derece 10 dakika degradeleri santrifüj. Kırık kloroplastlar ve bozulmamış mitokondri içeren üst faz, aspire etmek için bir su pompası kullanın.
Daha sonra, alt fazda bulunan bozulmamış kloroplastları almak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın, sağlam kloroplastlar ile birlikte tüpün dibinde bulunan çekirdekleri ve hücre enkaz aspire değil dikkatli olmak. Yıkama ortamı ile bozulmamış kloroplast süspansiyonu 3-4 kat seyreltin. SDS-Page ve Batı lekeleme tarafından daha fazla analiz için bozulmamış kloroplast fraksiyonu bir aliquot yaklaşık 10 mililitre tutun.
Santrifüj 2070 G ve dört santigrat derece iki dakika. Bundan sonra, yavaşça supernatant atın. Kalan supernatant aspire ve konsantre ham kloroplastlar içeren pelet tutmak için bir su pompası kullanın, buz üzerinde.
Saflaştırılabilen kloroplastları yumuşatmak için, proteaz inhibitörleri içeren hipotonik ortamda peleti yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan kloroplastları 10 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Metin protokolünde belirtildiği gibi sakaroz degradesini hazırlayın.
Peristaltik bir pompa kullanarak, önceden oluşmuş sakaroz degradelerinin her birinin üzerine üç mililitre lysed kloroplast yükleyin. Tüp çiftlerini dengelemek için hipotonik orta tampon kullanın ve ardından bir saat boyunca 70, 000 G ve dört santigrat derecede degradeyi ultra-santrifüj edin. Protein konsantrasyonunun belirlenmesinde kullanılmak üzere çözünür stromal proteinlerin bir aliquot alın.
Daha sonra, sarı bant kadar degrade kalan üst faz aspire etmek için bir su pompası kullanın. Bir pipet kullanarak, zarf olan sarı bandı alın. Zarfları tek bir tüpe çek.
Daha sonra, thylakoid pelet kadar degrade kalan faz kaldırın. Proteaz inhibitörleri ile membran yıkama tamponundaki thylakoid peletleri yeniden askıya alın. Tylakoid süspansiyon u seyreltin ve zarf yıkama ortamı ile üç ila dört kat, 10 mililitre için son hacmi ayarlayarak.
Membran yıkama tamponu ve ultra-santrifüj ile tüpler denge çiftleri 110, 000 G ve bir saat için dört derece santigrat onları. Bundan sonra, dikkatle supernatant aspire etmek için bir su pompası kullanın. Zarf peletine yaklaşık 100 mikrolitre membran yıkama tamponu ekleyin.
Sonra, thylakoid tüpten supernatant aspire. Membran yıkama tamponüç mililitre thylakoid pelet yeniden askıya. Diğer deneylerde kullanılmak üzere üç saf alt bölmeyi sıvı nitrojende saklayın.
Membran fraksiyonları kurtarıldıktan, yıkandıktan ve yoğunlaştıktan sonra, SDS-Page proteinleri ölçmek ve dört fraksiyonun bileşimini analiz etmek için kullanılır. Stromadan en bol protein RBCL'dir ve temsili sonuçlar beklenen sonucu gösterir, bu proteinin büyük alt ünitesinin çok azı thylakoid ve zarf membran fraksiyonları içerir. Işık hasat karmaşık proteinler ancak zarf membranlar kontamine olmalıdır bol thylakoid bileşenleridir.
Son olarak, fosfat triose fosfat translocator sadece saflaştırılmış zarf fraksiyonu görülebilir, zarf fraksiyonu güçlü zenginleştirme nedeniyle tüm kloroplast özleri ile karşılaştırıldığında. Üç alt bölmenin çapraz kontaminasyonu, stromadan çözünür ketol-asit reduktoisomeras, kloroplast zarf bakır ATPase ve thylakoid membranlardan gelen ışık toplama karmaşık proteinleri hem immünoblotting hem de kütle spektrometresi analizi kullanılarak ölçülebilir. Stroma genellikle zarf veya thylakoid fraksiyonları ile kontamine olmasa da, saflaştırılmış zarf fraksiyonları % 3 thylakoid proteinler ve stromadan proteinlerin %10'a kadarını içerir.
Thylakoidler stromadan gelen proteinler tarafından kötü kontamine edilirler, ancak zarf membran proteinlerinin %3'ünü içerirler. Kloroplastlar karbon asimilasyon gibi birçok önemli işlevleri gerçekleştirmek, kükürt, ve azot, yanı sıra temel metabolitlerin sentezi. Kloroplast fizyolojisini kontrol eden yeni düzenleyici mekanizmalarıde deşifre etmek için, kloroplast proteinlerinin surplast lokalizasyonunun tanımlanması süper hedefli çalışmalar için çok önemlidir.
Kloroplastlar çeşitli alt bölmeler içerir. Bu yöntem, spesifik kloroplast proteininin organel içinde bulunduğu yer gibi kloroplast alanındaki anahtar soruların yanıtlatılabılabilir. Bu prosedürü çalışırken, protea saf fraksiyonları içine direnmek emanet etmek için dört derece kloroplast izolasyon adımlarını tüm yapmak için hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, plastid alt bölmelerinin proteomunun bileşimi ve dinamiği gibi ek soruları cevaplamak için lascare proteomik yaklaşımlar gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra bitki fizyolojisi alanında araştırmacıların plastid alt bölmelerinde tanımlanan aday proteinlerin hedefli analizini kullanarak kloroplast biyogenezinin ve fonksiyonunun birçok farklı yönünü keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Proteaz inhibitörleri gibi belirli bileşikler üzerinde hacim blender, sıvı nitrojen ile çalışmanın özel bakım gerektirdiğini unutmayın.
Bu işlemi yaparken eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takmagibi önlemler her zaman alınmalıdır.
