Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет различать белки аналогичной деятельности, которые имеют различные роли, в зависимости от локализации в оболочке, строме или тилакоидных мембранах. Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться, потому что они будут использовать растения, которые являются слишком старыми, смесь листьев слишком долго, или не будет достаточно осторожным при повторном приостановлении гранулы нетронутыми, но хрупкие, хлоропласт. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как загрузка или восстановление фракции от percoll или в градиент шаги сахарозы трудно узнать.
Из-за риска смешивания градиентов и, следовательно, перекрестного загрязнения различных хлоропластовых подфракций. Демонстрация процедуры будет Имен Bouchnak, аспирант из нашей лаборатории и Лукас Мойет, крытый инженер. Для начала выращиваем арабидопсисные растения в течение пяти недель с 12-часовым световым циклом при 23 градусах Цельсия днем и 18 градусов по Цельсию ночью, с интенсивностью света 150 микромолер на квадратный метр в секунду.
На следующий день, предварительно взвесить пятилитровый стакан, а затем поместить его на лед. Урожай листья арабидопсиса, убедившись, чтобы избежать сбора любой почве. Повторное взвешивание стакана и запись веса ткани.
Перенесите собранные листья в холодную комнату. Поместите листья в блендер, содержащий два литра шлифовального буфера и гомогенизировать их путем смешивания на высокой скорости три раза в течение двух секунд каждый раз. Поместите четыре слоя муслина и один слой нейлонового синего текса в ситечко, и это для фильтрации гомогената.
Аккуратно сожмите смешанные листья внутри муслина и синего текса, чтобы извлечь всю жидкость. Восстановить оставшиеся ткани в чашке блендера и повторить процесс гомогенизации с помощью свежего буфера шлифования. Используйте четыре-пять слоев нового муслина для фильтрации этого нового гомогената в новом стакане, как описано ранее.
Равномерно распределим экстракт сырой клетки на шесть 500 миллилитровых бутылок. Поместите бутылки на лед. Центрифуга охлажденных бутылок при 2070 G и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут.
После этого аккуратно отбросьте супернатант. Используйте водяной насос, чтобы аспирировать любой оставшийся супернатант и держать гранулы, которые содержат концентрированный сырой хлоропласт, на льду. Используя 10 миллилитров пипетки, добавить три миллилитров стиральной среды к каждой бутылке, убедившись, что не использовать тонкие советы пипетки, чтобы избежать нарушения хлоропластов.
Затем используйте кисть краски или изогнутый пластиковый шпатель, чтобы аккуратно повторно приостановить гранулы. Используя 10 миллилитровую пипетку, соберите повторно приостановленные хлоропласты в одной трубке. Аккуратно инвертировать трубку, чтобы получить однородную подвеску хлоропласта.
Для начала используйте 10 миллилетер пипетки медленно загрузить шесть миллилитров подвески хлоропласта поверх каждого из шести подготовленных градиентов перколла. Используя качающийся ротор ведра, центрифуга градиенты на 13, 300 G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Используйте водяной насос, чтобы аспирировать верхнюю фазу, которая содержит сломанные хлоропласты и нетронутые митохондрии.
Затем используйте 10 миллилитровую пипетку для извлечения нетронутых хлоропластов, присутствующих в нижней фазе, будучи осторожными, чтобы не аспирировать ядра и клеточный мусор, найденный в нижней части трубки вместе с нетронутыми хлоропластами. Разбавить нетронутыми хлоропласт подвески три-четыре раза с стиральной среды. Храните около 10 миллилитров алицита нетронутой фракции хлоропласта для дальнейшего анализа SDS-Page и западной blotting.
Центрифуга при 2070 Г и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут. После этого аккуратно отбросьте супернатант. Используйте водяной насос, чтобы аспирировать любой оставшийся супернатант и держать гранулы, которая содержит концентрированные сырые хлоропласты, на льду.
Чтобы вылить очищенные нетронутые хлоропласты, повторно приостанавливайте гранулы в гипотонической среде, которая содержит ингибиторы протеазы. Перенесите повторно приостановленные хлоропласты в 10-миллилитровую соколиную трубку. Подготовь градиент сахарозы, как указано в текстовом протоколе.
Используя перистальтический насос, медленно загружайте три миллилитров лизайных хлоропластов поверх каждого из предварительно сформированных градиентов сахарозы. Используйте гипотонический средний буфер, чтобы сбалансировать пары труб, а затем ультра-центрифуга градиента на 70000 G и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа. Возьмите алицит растворимых стромальных белков, которые будут использоваться при определении концентрации белка.
Затем используйте водяной насос, чтобы аспирировать оставшуюся верхнюю фазу градиента до желтой полосы. Используя пипетку, извлечения желтой полосы, которая является конверт. Потяните конверты в одну трубку.
Затем удалите оставшуюся фазу градиента до тилакоидной гранулы. Повторно приостанавливайте тилакоидные гранулы в мембранном буфере для мытья с ингибиторами протеазы. Разбавить тилакоид подвески и конверт три-четыре раза с стиральной среды, регулируя окончательный объем до 10 миллилитров.
Баланс пары труб с мембранным буфером мытья и ультра-центрифуги их на 110000 G и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа. После этого используйте водяной насос, чтобы тщательно аспирировать супернатант. Добавьте в оболочку гранулы около 100 микролитров мембранного буфера для мытья.
Затем, аспирировать супернатант из тилакоидной трубки. Повторно приостанавливайте тилакоидные гранулы в трех миллилитров мембранного стирального буфера. Храните три очищенных подразряда в жидком азоте для использования в дальнейших экспериментах.
После того, как мембранные фракции восстанавливаются, промываются и концентрируются, SDS-Page используется для количественной оценки белков и анализа состава всех четырех фракций. Наиболее распространенным белком из стромы является РБКЛ, и репрезентативные результаты показывают ожидаемый результат, что очень мало большого субъединица этого белка содержит тилакоид и мембранные фракции оболочки. Светоуборочных сложных белков обильные тилакоидные компоненты, которые едва ли должны загрязнять мембраны конверта.
Наконец, фосфатный триоз фосфатный транслокатор виден только в очищенной фракции оболочки, из-за его сильного обогащения в оболочке фракции по сравнению со всей экстрактами хлоропласта. Перекрестное загрязнение трех подразрядов, растворимого кетолово-кислотного редуктора из стромы, хлоропластовой оболочки меди ATPase, а также светоуборочно-сложных белков из тилакоидальных мембран можно количественно оценить с помощью иммуноблотирования и анализа масс-спектрометрии. В то время как строма обычно не загрязнена фракциями конверта или тилакоида, очищенные фракции оболочки содержат 3%тилакоидных белков и до 10% белков из стромы.
Тилакоиды плохо загрязнены белками из стромы, но содержат до 3% белков мембраны конверта. Хлоропласты выполняют многие важнейшие функции, такие как усвоение углерода, серы и азота, а также синтез основных метаболитов. Для того, чтобы расшифровать новые механизмы регулирования, которые контролируют физиологию хлоропласта, определение локализации сюрпластики белков хлоропласт имеет решающее значение для супер-целевых исследований.
Хлоропласты содержат несколько подразрядов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хлоропласта, например, где специфический белок хлоропласта находится внутри органеллы. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы провести все шаги изоляции хлоропласта на четыре градуса, чтобы вернуть протеи сопротивляться в очищенные фракции.
После этой процедуры, другие методы, такие как lascare протеомные подходы могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как состав и динамика протеома значений пластидных подразрядов. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области физиологии растений, чтобы исследовать различные аспекты биогенеза хлоропласта и функции с использованием целевого анализа белков-кандидатов, выявленных в пластидных подразрядах. Не забывайте, что работа с объемным блендером, жидким азотом, на конкретных соединениях, таких как ингибиторы протеазы, требует особого ухода.
Такие меры предосторожности, как ношение перчаток, лабораторного пальто и защитных очков, всегда следует принимать во время выполнения этой процедуры.
