我们的协议帮助科学家分析单个上皮细胞中的亚细胞现象素网络，并允许他们在弯曲的上皮组织中以多细胞尺度进行类似的分析。我们的协议是斐济应用程序的一个很好的例子。它有一个直观的图形用户界面，它不需要任何脚本知识。
因此，它非常适合新手用户在外地。虽然我们的方法是为果蝇卵室开发的，但它也适用于果蝇表皮外。我们鼓励科学家在他们的模型系统中测试我们的协议。
使用附带的测试文件来熟悉此协议。它将帮助你决定此协议的哪一部分适合您的个人研究问题。协议的这一部分允许用户在延时电影中分割上皮细胞，然后使用 Surface Manager 分析单个细胞中偶发素脉冲。
首先，打开斐济，并导入宏组织细胞段电影。ijm，如随附的文本协议中所述。然后，打开漂白剂校正的 TIFF 文件，然后通过进入菜单栏、选择"图像"、后跟"颜色"和"拆分通道"来拆分漂白校正文件的通道。
通过按打开脚本中的图标"运行"，在所选延时影片的活动单元膜通道上运行上传脚本。为了获得漂亮的单元格蒙版，请将高斯模糊设置为 2.500，将单元格检测灵敏度设置为负 1，然后单击"确定"。然后，为使用 63 倍目标获得的延时影片设置 10 到 20 之间的估计噪声容差，然后单击"确定"。生成的单元格蒙版将显示在分析的延时影片中，出现名为 ParticleStack 的新窗口，同时出现一个名为"需要操作"的小窗口。从延时影片上的单元格蒙版中，只关注中心中的单元格，并选择那些能够在整个延时影片中提供完整且定义良好的轮廓的单元格。
当中心中的选定单元格与真实细胞膜很好地对应时，请将 ParticleStack 保存为 TIFF 文件。在斐济打开相应的粒子堆栈 TIFF 文件。在斐济安装了 Surface Manager 插件，打开该插件。
在 Surface Manager 中，单击"读取大纲"图像按钮，将 Jaccard 索引设置为 60% 加载大纲可能需要几分钟时间，具体取决于单元格数。加载后，每个单元格将被分配一个 S 编号，并显示在 Surface Manager 窗口的左侧。单击选定的 S 编号，以便从 ParticleStack1 导入的单元格轮廓。
蒂夫出现在延时电影中。检查整个影片的每个导入的 S 编号的单元格轮廓质量，并删除显示不正确的单元格轮廓的不需要的单元格。要删除不需要的单元格，请突出显示单元格轮廓，然后单击"删除"按钮。
使用"画笔"工具校正单元格轮廓。完成后，将更正后的单元格另存为 RoiSet。zip 文件。
要确定阿波米奥辛脉冲是否存在于分析组织中，并了解详细行为，以及阿波米奥辛信号的方向性，首先打开斐济。打开延时影片，加载保存的 ParticleStack1。tiff 单元格掩码和漂白校正的延时影片，然后从 RoiSet 加载 Surface Manager 插件和相应的感兴趣区域。
zip 文件。接下来，在 Surface Manager 中，激活具有感兴趣信号的通道。单击"统计"按钮可获取名为"按切片显示的平均灰色值切片"的窗口。
随着时间的推移，以任意单位以及与细胞的面积和形状相关的其他参数显示的公理和中值强度。通过进入"统计信息"窗口、单击"文件"并选择"另存为.类似"、生成单元格掩码并加载到 Surface Manager 中以分析组织规模上的公理脉冲来将值保存为电子表格文件。该协议的这一部分允许用户有选择地在弯曲的上皮组织中选择性地提取一层薄薄的幕于一切。
这些步骤是用户友好的，基于直观的图形界面。打开斐济，并确保安装椭圆形表面投影插件。然后，打开延时影片，然后通过单击插件、访问 BigDataViewer 并选择导出当前图像作为 XML/HDF5 文件来将它导出为 XML/HDF5 文件。
接下来，通过进入插件、单击 BigDataViewer、然后是椭圆体曲面投影并选择 XML 文件，打开 Ellipsoid 曲面投影中导出的文件。这将打开一个新窗口，显示蛋室的下垂视图，并会出现一个对话框，以指导用户完成处理。对话框窗口称为"卵巢投影"，具有多个选项卡。
在第一个对话框选项卡（称为边界框）中，定义延时影片中蛋室的 x 和 y 边框以及边界框的 z 宽度，然后按 set。蛋室的选定部分以粉红色突出显示。接下来，在"Ovaries 投影"窗口中称为"查找 Blob"的对话框选项卡中定义信号 Blob 的大小。
定义西格玛和最小峰值。然后，按计算以识别将显示为绿色斑点的 Actomyosin 信号。用不同的参数重试此步骤，直到找到大约 100 个点。
识别行为yosin信号是关键步骤。这取决于信号质量和检测到的 Blob 的正确大小。如果图像中没有可见的绿色点，则下一步将不起作用。
要设计椭圆体，请继续使用称为"拟合椭圆体"的选项卡。将随机样本设置为 10，000，将外部/内部截止距离设置为 1 到 10，然后单击计算。在此之后，称为投影的选项卡将自动打开并允许定义曲面提取。
在投影选项卡中，将最小和最大投影距离设置为所需椭圆的宽度。最小和最大的投影距离必须适合，以便粉红色定义的椭圆形区域包括蛋室的整个外部层。然后，将切片距离定义为 1。
在按下计算之前，请确保在蛋室上定义椭圆的粉红色区域是可见的。它有助于评估新的椭圆形拟合的质量。接下来，将椭圆的输出宽度设置为大于或等于 800，将高度设置为大于或等于 400。
然后，设置曲面提取的持续时间，然后选择球形投影或圆柱投影。如果需要，翻转 Z 并对齐 Y.Press 计算，以获取称为图像的新窗口中两个通道的表面提取。调整获得的图像窗口的亮度和对比度，通过单击图像、进行"调整"和选择亮度/对比度来查看投影的幕度信号。
如果曲面提取看起来不错，请将两个通道单独保存为 TIFF 文件。此外，保存日志窗口文件，供将来参考如何提取此特定蛋室的表面。然后，将通道与斐济中的首选颜色代码合并，并将结果另存为 TIFF 文件。
该协议使科学家能够研究上皮组织中法霉素网络的行为。只有当对局部细胞尺度上的行为进行详细分析与组织尺度上的类似分析相结合时，才可能实现这一点。此处显示的动态 myosin II 行为在本地细胞规模和在控制组织和脂肪 2 突变果蝇卵室的组织量表的代表示例。
在基底单平面上，明辛II信号的绿色改性调节光链垂直于控制蛋室的前部后轴。这种极性在脂肪2突变蛋室中丢失，并导致各向异性骨髓II脉冲，在组织水平上振荡，控制样品中米奥辛II的绿色修饰调节光链产生促进上皮旋转所需的同步力。相比之下，fat2突变蛋室的卵泡上皮在基底侧脉冲强烈，不能产生促进上皮旋转所需的同步力。
在果蝇卵室的薄层区域，fat2突变体还呈现了霉素II的绿色改性调节光链的动态行为变化。 在观看此视频后，您应该有一个好主意，如何使用斐济的果蝇蛋室在局部和组织尺度上分析果蝇蛋白网络。有关进一步的实际提示和故障排除，请参阅协议后的讨论部分。如果您对斐济或我们的插件有任何疑问，请参阅相应的网页或联系我们。
