Наш протокол помогает ученым анализировать субклеточную сеть актомиозина в отдельных эпителиальных клетках, а также позволяет им проводить подобный анализ в многоклеточной шкале в изогнутых эпителиальных тканях. Наш протокол является хорошим примером приложения Фиджи. Он имеет интуитивно понятный графический пользовательский интерфейс, и он не требует каких-либо знаний о сценарии.
Таким образом, он очень подходит также для начинающих пользователей в этой области. Хотя наш метод был разработан для drosophila яичные камеры, это также применимо за пределами эпителии Drosophila. Мы призываем ученых протестировать наш протокол в своих модельных системах.
Используйте сопровождаемые тестовые файлы, чтобы ознакомиться с этим протоколом. Это поможет вам решить, какая часть этого протокола подходит для вашего индивидуального исследовательского вопроса. Эта часть протокола позволяет пользователям сегментировать эпителиальные клетки в фильмах замедленного действия и впоследствии анализировать актомиозин импульсы в отдельных клетках с течением времени с помощью Surface Manager.
Для начала откройте Фиджи и импортируем макро TissueCellSegmentMovie. ijm, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем откройте исправленный отбеливателем файл TIFF и разделите каналы исправленного отбеливателя файла, заехав в бар меню, выбрав изображение, а затем Цвет и выбрав сплит-каналы.
Вы запустите загруженный скрипт на активном клеточном мембранном канале выбранного фильма замедленного действия, нажав значок Run в открытом скрипте. Для того, чтобы получить хорошую маску ячейки, установить Gaussian размытия до 2500 и чувствительность обнаружения клеток до минус одного, и нажмите OK. Затем установите расчетную шумоустойчивость от 10 до 20 для фильмов замедленного действия, приобретенных с целью 63x, и нажмите OK. В анализируемом фильме замедленного действия появляется генерируемая ячейка, появляется новое окно под названием ParticleStack, а также появляется небольшое окно под названием Action Required. Из маски ячейки в замедленном фильме сосредоточьтесь только на ячейках в центре и выберите те, которые могут обеспечить полные и четко определенные контуры на протяжении всего фильма замедленного действия.
Когда выбранные клетки в центре хорошо соответствуют реальным клеточным мембранам, сохраните ParticleStack в качестве файла TIFF. Откройте соответствующий файл ParticleStack TIFF на Фиджи. С помощью плагина Surface Manager, установленного на Фиджи, откройте плагин.
В Surface Manager нажмите кнопку изображения Контур чтения и установите индекс Jaccard до 60%, загрузка контуров может занять несколько минут в зависимости от количества ячеек. После загрузки каждой ячейке будет присвоен номер S и он появится в левой части окна Surface Manager. Нажмите на выбранный номер S, чтобы контур импортированных ячеек от ParticleStack1.
tiff появляется на замедленном фильме. Проверьте каждый импортированный номер S на качество контура ячейки на протяжении всего фильма и удалите нежелательные ячейки, отображая неправильные контуры ячеек. Чтобы удалить нежелательную ячейку, выделите контур ячейки и нажмите на кнопку Удалить.
Используйте инструмент Brush для коррекции контуров ячеев. После завершения, сохранить исправленные ячейки, как RoiSet. почтовый файл.
Определить, присутствуют ли актомиозиновые импульсы в анализируемой ткани и понять детальное поведение, а также направленность сигналов актомиозина, начните с открытия Фиджи. Откройте фильм замедленного действия, загрузите сохраненный ParticleStack1. Tiff сотовая маска и отбеливатель исправленный промежуток времени фильм, а затем загрузить Surface Manager плагин и соответствующую область интереса от RoiSet.
почтовый файл. Далее, в Surface Manager, активировать канал с сигналами интереса. Нажмите кнопку Статистика, чтобы получить окно под названием Среднее серое значение Фрагмент за ломтиком.
Средняя и медианная интенсивность сигналов актомиозина будет отображаться с течением времени в произвольных единицах, а также других параметрах, связанных с областью и формой клетки. Сохраните значения в качестве файла электронной таблицы, заехав в окно Статистики, нажав на файл и выбрав Save As.Similarly, создайте маску ячейки и загрузите ее в Surface Manager, чтобы проанализировать импульсы актомиозина в шкале тканей. Эта часть протокола позволяет пользователям выборочно извлекать тонкий слой актомиозина в изогнутой эпителиальной ткани с течением времени.
Эти шаги удобны и основаны на интуитивно понятном графическом интерфейсе. Откройте Фиджи и убедитесь, что плагин Ellipsoid Surface Projection установлен. Затем откройте покадровой фильм и экспортуте его в качестве файла XML/HDF5, нажав на плагины, перейдите на BigDataViewer и выбрав Export Current Image в качестве файла XML/HDF5.
Затем откройте экспортируемый файл в эллипсоидной проекции поверхности, перейдите на Плагины, нажав на BigDataViewer, а затем Эллипсоидная проекция поверхности и выбрав файл XML. Это откроет новое окно с sagittal мнениями яичной камеры, и диалог, чтобы направлять пользователя через обработку появится. Окно диалога, называемое Проекция яичников, имеет несколько вкладок.
В первой вкладке диалога, называемой обвяжающая окно, определите границы x и y яичной камеры в фильме замедленного действия вместе с шириной z коробки границ и набором прессы. Выбранные части яичной камеры выделены розовым цветом. Затем определите размер капли сигнала в вкладке диалог, называемой «найти капли» в окне проекции яичников.
Определите сигму и минимальное пиковое значение. Затем нажмите вычисления, чтобы определить сигналы актомиозина, которые будут отображаться как зеленые капли. Повторить этот шаг с различными параметрами, пока около 100 пятен находятся.
Определение сигналов актомиозина является важным шагом. Это зависит от качества сигнала и правильного размера обнаруженных капли. Если на изображении нет видимых зеленых пятен, то следующий шаг не сработает.
Для разработки эллипсоидов, продолжить с вкладкой называется подходят эллипсоид. Установите случайные образцы до 10 000, расстояние отсечения снаружи/внутри до 10, а затем щелкните вычисления. После этого вкладка, называемая проекцией, автоматически откроется и позволит дать определение извлечения поверхности.
В проекционной вкладке установите минимальное и максимальное проекционные расстояния в качестве ширины желаемого эллипсоида. Минимальное и максимальное расстояние проекции должно соответствовать так розовый определенный эллипсоидный регион включает в себя весь внешний слой яичной камеры. Затем определите расстояние среза как одно.
Убедитесь, что розовая область эллипсоида с определенным на яичной камере видна перед нажатием вычисления. Это помогает оценить качество нового эллипсоида подходят. Затем установите выходную ширину эллипсоида больше или равную 800 и высоту, которая больше или равна 400.
Затем установите продолжительность извлечения поверхности и выберите либо сферическую, либо цилиндрическую проекцию. При необходимости переверните и выровняете вычисления Y.Press, чтобы получить извлечение поверхности для обоих каналов в новых окнах, называемых изображением. Отрегулируйте яркость и контрастность полученных окон изображения, чтобы иметь возможность видеть проецируемые сигналы актомиозина, нажав на изображение, отрегулируя и выбрав яркость/контрастность.
Если извлечение поверхности выглядит хорошо, сохраните оба канала отдельно, как файлы TIFF. Кроме того, сохраните файл окна журнала для будущей ссылки на то, как была извлечена поверхность этой конкретной яичной камеры. Затем объединить каналы с предпочтительным цветовым кодом на Фиджи, и сохранить результаты, как TIFF файлов.
Данный протокол позволяет ученым исследовать поведение актомиозиновых сетей в эпителиальных тканях. Это возможно только тогда, когда детальный анализ поведения актомиозина в местной клеточной шкале сочетается с аналогичным анализом в шкале тканей. Здесь показаны репрезентативные примеры динамического поведения миозин II в локальной клеточной шкале и в шкале тканей для контроля и жира2 мутанта Drosophila яичных камер.
На базальной одной плоскости зеленая модифицированная регулятивная световая цепь сигналов миозин II переходит перпендикулярно передней-задней оси контрольных яичных камер. Эта полярность теряется в камерах мутантных яиц fat2 и приводит к анисотропным импульсам миозин II, колебаниям на уровне тканей, зеленой модифицированной регулятивной световой цепи миозин II в контрольном образце генерирует синхронизированную силу, необходимую для содействия эпителиального вращения. В отличие от этого, фолликул эпителий жира2 мутантной яичной камеры импульс сильно на базальной стороне и не в состоянии генерировать синхронизированную силу, необходимую для содействия эпителиального вращения.
В тонкой апической области яичной камеры Drosophila, мутант fat2 также представляет с измененным динамическим поведением зеленой модифицированной регулятивной световой цепи myosin II.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее представление о том, как проанализировать сеть актомиозина на местном и тканевой шкале в яичной камере Drosophila с помощью Фиджи. Дополнительные практические советы и устранение неполадок, пожалуйста, смотрите обсуждение части после протокола. Если у вас есть какие-либо вопросы, связанные с Фиджи или наши плагины, смотрите соответствующие веб-страницы или свяжитесь с нами.
