Nosso protocolo ajuda os cientistas a analisar a rede de actomiose subcelular em células epiteliais individuais e também permite que eles realizem análises semelhantes em escala multicelular em tecidos epiteliais curvos. Nosso protocolo é um bom exemplo de uma aplicação Fiji. Ele tem uma interface de usuário gráfica intuitiva, e não requer nenhum conhecimento de scripting.
Portanto, é altamente adequado também para usuários iniciantes no campo. Embora nosso método tenha sido desenvolvido para câmaras de óvulos Drosophila, também é aplicável fora da epitélia de Drosophila. Encorajamos os cientistas a testar nosso protocolo em seus sistemas de modelos.
Use os arquivos de teste acompanhados para se familiarizar com este protocolo. Ele vai ajudá-lo a decidir qual parte deste protocolo é adequado para sua pergunta de pesquisa individual. Esta parte do protocolo permite que os usuários segmentem células epiteliais em filmes com lapso de tempo e, posteriormente, analisem pulsos de actomiosina em células individuais ao longo do tempo usando o Surface Manager.
Para começar, abra Fiji e importe o macro TissueCellSegmentMovie. ijm como descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, abra um arquivo TIFF corrigido por alvejante e divida os canais do arquivo corrigido pelo alvejante indo até a barra de menu, selecionando Imagem, seguido por Color e selecionando Canais Split.
Execute o script carregado no canal de membrana celular ativa do filme de lapso de tempo selecionado pressionando o ícone Executar no script aberto. Para obter uma máscara celular agradável, ajuste o borrão gaussiano para 2.500 e a sensibilidade de detecção de células para menos um, e clique em OK. Em seguida, defina a tolerância de ruído estimada entre 10 e 20 para filmes de lapso de tempo adquiridos com o objetivo de 63x, e clique em OK. Uma máscara de célula gerada aparece no filme de lapso de tempo analisado, uma nova janela chamada ParticleStack aparece, e uma pequena janela chamada Action Required também aparece. A partir da máscara celular no filme time-lapse, concentre-se apenas nas células no centro e selecione aquelas que podem fornecer contornos completos e bem definidos ao longo do filme time-lapse.
Quando as células selecionadas no centro correspondem bem às membranas celulares reais, salve particleStack como um arquivo TIFF. Abra o arquivo TIFF particleSack correspondente em Fiji. Com o plugin Surface Manager instalado em Fiji, abra o plugin.
No Surface Manager, clique no botão De imagem de contorno de leitura e defina o índice Jaccard para 60% Carregar os contornos pode levar vários minutos dependendo do número de células. Uma vez carregada, cada célula receberá um número S e aparecerá na parte esquerda da janela Surface Manager. Clique no número S selecionado para que o esboço da célula importada de ParticleStack1.
Tiff aparece no filme time-lapse. Verifique cada número S importado para obter qualidade de contorno celular durante todo o filme e remova células indesejadas que exibem contornos celulares incorretos. Para remover uma célula indesejada, destaque o contorno da célula e clique no botão Excluir.
Use a ferramenta Pincel para corrigir contornos celulares. Quando terminar, salve as células corrigidas como um RoiSet. arquivo zip.
Para identificar se os pulsos de actomyosina estão presentes no tecido analisado e entender o comportamento detalhado, bem como a direcionalidade dos sinais de actomyosina, começam pela abertura de Fiji. Abra um filme de lapso de tempo, carregue o ParticleStack1 salvo. máscara de célula de tiff e o filme de lapso de tempo corrigido por alvejante, em seguida, carregar o plugin Surface Manager e a região correspondente de interesse do RoiSet.
arquivo zip. Em seguida, no Surface Manager, ative um canal com sinais de interesse. Clique no botão Estatísticas para obter a janela chamada Valor cinza médio Fatia por Fatia.
As intensidades médias e medianas dos sinais de actomiose serão exibidas ao longo do tempo em unidades arbitrárias, bem como outros parâmetros relacionados à área e forma da célula. Salve os valores como um arquivo de planilha indo para a janela Estatísticas, clicando em Arquivo e selecionando Salvar As.Da mesma forma, gerar uma máscara celular e carregá-lo no Surface Manager, a fim de analisar pulsos de actomyosina na escala de tecido. Esta parte do protocolo permite que os usuários extraam seletivamente uma fina camada de actomiosina no tecido epitelial curvo ao longo do tempo.
Essas etapas são fáceis de usar e baseadas em uma interface gráfica intuitiva. Abra Fiji e certifique-se de que o plugin Ellipsoid Surface Projection esteja instalado. Em seguida, abra uma foto de lapso de tempo e exporte-a como um arquivo XML/HDF5 clicando em Plugins, indo para o BigDataViewer e selecionando Export Current Image como arquivo XML/HDF5.
Em seguida, abra o arquivo exportado no Ellipsoid Surface Projection indo para Plugins, clicando no BigDataViewer, seguido por Ellipsoid Surface Projection e selecionando arquivo XML. Isso abrirá uma nova janela com vistas sagidoras da câmara de ovos, e um diálogo para orientar o usuário através do processamento aparecerá. A janela de diálogo, chamada Projeção de Ovários, tem várias abas.
Na primeira guia de diálogo, chamada de caixa de delimitamento, defina as bordas x e y de uma câmara de ovo no filme de lapso de tempo juntamente com a largura z da caixa de delimitação e pressione o conjunto. As partes selecionadas da câmara de ovos são destacadas em rosa. Em seguida, defina o tamanho das bolhas de sinal na guia de diálogo chamada encontrar bolhas na janela projeção dos ovários.
Defina o sigma e o valor mínimo de pico. Em seguida, pressione a computação para identificar os sinais de actomiose, que aparecerão como bolhas verdes. Tente novamente esta etapa com diferentes parâmetros até que cerca de 100 pontos sejam encontrados.
Identificar os sinais de actomiose é um passo crucial. Depende da qualidade do sinal e do tamanho correto das bolhas detectadas. Se não houver manchas verdes visíveis na imagem, então o próximo passo não funcionará.
Para projetar o elipsoide, continue com a aba chamada fit ellipsoid. Defina amostras aleatórias para 10.000, a distância de corte externa/interna para um a 10 e, em seguida, clique em calcular. Depois disso, a guia chamada projeção será aberta automaticamente e permite a definição da extração da superfície.
Na guia de projeção, configure uma distância mínima e máxima de projeção como a largura do elipsoide desejado. A distância mínima e máxima de projeção deve caber para que a região elipsoide definida rosa inclua toda a camada externa da câmara de ovos. Em seguida, defina a distância da fatia como uma só.
Certifique-se de que a região rosa do elipsoide com o definido com na câmara de ovo é visível antes de pressionar a computação. Ajuda a avaliar a qualidade de um novo elipsoide. Em seguida, defina uma largura de saída do elipsoide para maior ou igual a 800 e uma altura maior ou igual a 400.
Em seguida, defina a duração da extração da superfície e escolha uma projeção esférica ou cilíndrica. Se necessário, vire Z e alinhe a computação Y.Press para obter uma extração de superfície para ambos os canais em novas janelas chamadas imagem. Ajuste o brilho e o contraste das janelas de imagem obtidas para poder ver os sinais de actomyosina projetados clicando em Imagem, indo ajustar e selecionando Brilho/Contraste.
Se a extração de superfície parecer boa, salve ambos os canais separadamente como arquivos TIFF. Além disso, salve o arquivo da janela Log para referência futura sobre como a superfície desta câmara de ovo em particular foi extraída. Em seguida, mescle os canais com um código de cor preferido em Fiji e salve os resultados como arquivos TIFF.
Este protocolo permite que os cientistas investiguem o comportamento das redes de actomiose em tecidos epiteliais. Isso só é possível quando uma análise detalhada do comportamento da actomyosina na escala celular local é combinada com uma análise semelhante na escala tecidual. Aqui são mostrados exemplos representativos do comportamento dinâmico da minosina II na escala celular local e na escala de tecido para controle e fat2 mutante câmaras de ovos Drosophila.
No plano único basal, a cadeia de luz regulatória modificada verde dos sinais de miosina II movem-se perpendiculares para o eixo anterior-posterior das câmaras de ovos de controle. Esta polaridade é perdida em câmaras de ovos mutantes fat2 e leva a pulsos de miosina anisotropic II, oscilações No nível tecidual, a cadeia de luz regulatória modificada verde da minosina II na amostra de controle gera a força sincronizada necessária para promover a rotação epitelial. Em contraste, o epitélio folículo de uma câmara de ovo mutante fat2 pulsa fortemente no lado basal e não consegue gerar a força sincronizada necessária para promover a rotação epitelial.
Em uma região apical fina da câmara de ovos Drosophila, o mutante fat2 também apresenta o comportamento dinâmico alterado da cadeia de luz regulatória modificada verde da minosina II.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como analisar uma rede de actomiose na escala local e tecidual em câmaras de ovos Drosophila usando Fiji. Para mais dicas práticas e solução de problemas, consulte a parte de discussão após o protocolo. Se você tiver alguma dúvida relacionada a Fiji ou nossos plugins, consulte as respectivas páginas da Web ou entre em contato conosco.
