食品和环境样品中沙门氏菌的准总体基因体分析

该方法可用于检测食品样品中的沙门氏菌，并通过基因指纹识别病原体至菌株水平。该技术的主要优点是，它结合了沙门氏菌检测和亚分到一个工作流程，并大大缩短了从沙门氏菌污染食品样品到病原体指纹的周转时间。首先，无菌地将 25 克食物样品放入无菌实验室搅拌袋中，并配有内置过滤器，或者可选地准备环境拭子，用浓缩汤对海绵进行无菌润湿，将其拖过预先确定的表面，然后放入搅拌袋中。

使用实验室搅拌机，将每个样品与 225 毫升 RV 浓缩汤彻底混合。然后在42摄氏度下孵育混合物4至21小时。在此之后，从袋子的过滤侧收集50毫升的浓缩汤。

然后在100次g下将子组离心10分钟。小心地将上一代转移到一个新的50毫升离心管中，并在3000至6000次g下将离心机转移到10分钟。丢弃上一杯，用五毫升BPW洗涤颗粒。

将颗粒重新用五毫升的 BPW 重新暂停。首先，在冰上解冻样品缓冲液和MDA试剂盒的反应缓冲液。将一毫升的再增电池放在BPW中，将20微升的抗沙门氏菌珠放在微离心管中。

将微离心管放在旋转搅拌机上，在室温下放置 30 分钟。在此之后，将管子放在磁性支架上三分钟。多次反转磁架，将珠子浓缩成颗粒。

将管子放在磁架上，吸气并丢弃上一液。接下来，向管子中加入一毫升的洗涤缓冲液。从机架中取出管架支架，并多次反转管架，以清除复合体中任何非特别结合的细菌。

第三次洗涤后，从管子中吸出上经液并丢弃。然后从磁架上取下管子，将其离心一秒钟。然后将管子放在磁性机架上三分钟，然后取出任何残留的洗涤缓冲液。

将珠沙门氏菌复合物重新填充在9微升样品缓冲液中，并在95摄氏度下孵育管子3分钟。冷却冰上复合物后，加入9微升的反应缓冲液和1微升酶混合物。根据文本协议在热循环器中孵育管，并在冰上冷却管。

接下来，使用荧光光谱仪测量样品的DNA浓度和纯度。将最终产品储存在负20摄氏度，用于未来的实验。根据文本协议，每个样品制备 18 微升 PCR 混合物。

然后通过轻轻上下移液混合MDA产品。在PCR混合物中加入两个微升的MDA产品悬浮液。使用优化的实时 PCR 协议，根据文本协议运行实时 PCR。

如文本协议中的规定，向 MDA 产品添加缓冲液和试剂，并将测序的 40 微升将 MDA 产品转移到新板中，并将 20 微升 PCR 纯化珠添加到每个井中。接下来，在室温下孵育板10分钟。然后用80%乙醇清洗珠子，然后干燥12分钟。

将干珠重新在53微升的再增缓冲液中，在室温下孵育珠子两分钟。最后，根据制造商的说明稀释和池库。在此协议中，通过实时PCR对沙门氏菌DNA进行有针对性的数量评估。

两个品牌沙门氏菌污染鸡胸肉的代表性结果从每微升701.54到945.86南克，表明样本DNA被有效放大。在尝试此程序时，必须记住仔细清洗和处理 IMS 珠子，使 MDA 试剂和产品无污染物，并保持清洁罩。该技术开发后，为食品安全和公共卫生领域的研究人员探索食品样品、产品环境和供应链中沙门氏菌污染物的快速、高分辨率跟踪铺平了道路。

不要忘记，使用食源性病原体可能极其危险，在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备和遵循良好的实验室做法。